驾驭反转录——从试验的成败到前沿技术-全式金.PDFVIP

驾驭反转录——从实验的成败到前沿技术 北京全式金生物技术有限公司 反转录酶概述 RNA模板制备与反转录 反转录实验策略 反转录的应用 反转录酶概述 • 反转录酶发现历史 • 反转录酶简介 1975年诺贝尔生理和医学奖 David Bahirsore Howard Martin Tersin Renato Dulbecco 1975年诺贝尔生理和医学奖 • Baltimore, D. (1970) RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. Nature 226, 1209-11 • Temin, H. M., and Mizutani, S. (1970) RNA-dependent DNA polymerase in virions of Rous sarcoma virus. Nature 226, 1211-3 • 发现了逆转录酶，证明遗传信息不仅由DNA到RNA， 也可由RNA到DNA 反转录酶的酶学特性 • 具有依赖于DNA或RNA模板的DNA聚合酶活性 相对于DNA模板，以RNA为模板时具有更高的比活性 没有3’和5’外切核酸酶的活性，因此没有校正功能 • 具有降解DNA:RNA杂合双链中RNA 的RNase H 活性 反转录酶的酶学特性 • 两种活性均为病毒复制循环所必需 Coffin, J. M., Hughes, S. H., and Varmus, H. E. (1997) Retroviruses, Cold Spring Harbor Laboratory Press • 两个活性中心在结构上是相互独立、单独折叠 的两个结构域，在RT上的相对位置固定 DNA 聚合酶结构域位于N端，RNase H结构域位于C端 反转录酶的结构研究 Kohlstaedt L A,Wang J,Friedman F M,Rice P A and Steitz T A,1992.Cristal structure at 3.5 angstrom resolution of HIV-1 reverse transcriptase complex with an inhibitor.Science,256:1783~1790 提出了HIV-1 RT酶的右手结构模型 手指：与合成中引入的脱氧核苷酸相互作用 手掌：催化磷酸转移 拇指：与模板相互作用 反转录酶的结构研究 DNA聚合酶 活性中心 手指：红色 RNaseH 手掌：蓝色 活性中心 拇指：绿色 RNaseH ：紫色 The structure of MMLV RT （2004 ） DNA聚合酶活性 ——持续合成能力 • 指酶与引物/模板结合，延伸，解离这样一个循环所能 掺入的核苷酸的平均数目 • RT 的持续合成能力比较低，通常条件下小于1 kb • 要继续链的延伸，必需有RT分子重