6种草本药用植物种子超低温保存技术研究.docVIP

　　6种草本药用植物种子超低温保存技术研究 超低温冷冻保存指将材料放置在低于-80 ℃的环境中保存，通常是用液氮（-196 ℃）作为贮藏源，大多数的植物种质在液氮中新陈代谢活动基本停止，处于“生机停顿”状态[1]，可以达到长期保存的目的。因此已被广泛应用于生物种质的长期保存，应用范围也在不断扩大[2]。目前超低温冷冻保存已成功应用于植物材料、动物干细胞、鱼虾精细胞、微生物等的保存。其中植物材料包括种子、悬浮细胞[3]、愈伤组织[4]、胚[5-6]、花粉[7]、茎尖分生组织[8]、芽等。国内外针对药用植物种子超低温保存的研究不多，李海兵等[9]对怀山药种质、何明高等[10]对束花石斛种子、任淑娟等[11]对七叶树种子、Hirano等[12]对白芨种子进行了超低温保存，在药用植物种质超低温保存方式、种子含水量、化冻方式对超低温保存后种质存活率的影响取得了成果。　　草本植物是区别于木本植物的一类植物的总称，包括重要的粮食如小麦、玉米等，且有很多草本植物是中药材的重要，例如黄芪、夏枯草、人参等。本研究对具有药用价值的杜若、过江藤、夏枯草、皱果苋、罗勒和山香等6种草本药用植物种子进行超低温保存研究，对这些药用植物种子超低温保存的可行性和技术方法进行了探讨，为具有药用价值的草本植物的保护性开发提供技术。　　1 材料与方法　　1.1 材料　　供试材料来自海南和广东的草本植物杜若、过江藤、夏枯草、皱果苋、罗勒和山香种子，由国家南药基因资源库提供（表1）。　　1.2 方法　　1.2.1 种子含水量测定 根据《国际种子检验规程》（ISTA编，1999）采用高温烘干法测定种子含水量（ω0），烘干温度（103±2）℃，烘干时间16 h。ω0=（鲜重-绝干重）/鲜重×100%。　　1.2.2 种子干燥 采用硅胶干燥法。将种子放入盛有硅胶的干燥器中，根据自然含水量经不同時间干燥分别获得含水量为13.50%（自然含水量）、11.90%、9.68%、7.89%和5.71%的杜若种子，含水量为11.20%（自然含水量）、10.69%、9.69%、8.44%和8.10%的过江藤种子，含水量为10.63%（自然含水量）、9.88%、8.02%和6.99%的夏枯草种子，含水量为16.18%（自然含水量）、13.88%、12.75%、10.67%和8.56%的皱果苋种子，含水量为26.33%（自然含水量）、20.87%、18.18%、13.86%和7.78%的罗勒种子和含水量为12.82%（自然含水量）、9.09%、7.63%、5.45%和4.55%的山香种子。 1.2.3 种子发芽方法 参照《国际种子检验规程》的规定。各试验4个重复，每重复40粒。计算出种子（种胚）的发芽率=种子发芽数/实验种子数×100%。　　1.2.4 超低温保存方法 目前使用的液氮超低温保存方法主要有：缓慢冷冻法、直接冷冻法、玻璃化冷冻法、包埋脱水冷冻法、包埋玻璃化冷冻法等。根据实际情况，本实验选用缓慢冷冻法、直接冷冻法和玻璃化冷冻法对6种草本药用植物种子进行液氮超低温保存实验。　　缓慢冷冻法：将种子放入加有保护液（PVS2）（室温）的冻存管中，置于4 ℃冰箱中0.5 h，取出立即放入-20 ℃冰柜中1 h，1 h后迅速投入液氮中保存。PVS2：30%甘油+15%乙二醇+15%二甲亚砜+0.4 mol/L蔗糖。　　直接冷冻法：将种子放入冻存管中直接投入液氮中保存。　　玻璃化冷冻法：将种子放于装载液（LS）中室温处理20 min后，转入PVS2进行30 min的冰水浴处理。冰水浴处理后将种子转移至装有预冷新鲜PVS2的冻存管中，迅速投入液氮中保存。LS：含2 mol/L甘油和0.4 mol/L蔗糖的MS液体培养基。　　解冻：取出液氮中冻存48 h的冻存管，室温化冻5 min。　　洗涤：将解冻后的种子在室温下用洗涤液（US）洗涤2～3次，每次5～10 min，再用无菌水洗涤2～3次，每次5～10 min。US：含有1.2 mol/L蔗糖的MS培养液。　　恢复培养：洗涤后的种子在滤纸上吸干后，转移至发芽盒， 25～30 ℃、70%RH条件下培养。　　1.3 数据分析　　数据采用SAS软件和Excel（2016）软件进行统计分析。　　2 结果与分析　　2.1 超低温保存对种子发芽率的影响　　超低温保存种子效果的判定一般采用测定发芽率的方法，以种子进入液氮一段时间取出后有一定的发芽率来判定保存方法的成功与否[22]。本实验6种草本药用植物种子经液氮处理后都有一定的发芽率，具体结果见表2。从表2可以看出，液氮超低温冷冻对草本药用植物种子发芽率影响不同，与对照组相比，其种子平均发芽率有降低的，也有提高的。经3种不同冷冻方式处理冷冻后，杜若、夏枯草和皱果苋种子发芽率与对照相比，差异不显著（pgt;0.