基因工程与基因重组.ppt

  1. 1、本文档共95页,可阅读全部内容。
  2. 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
  3. 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载
  4. 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
查看更多
基因工程与基因重组

您已经掌握基因克隆的主要步骤! 分离目的基因和载体DNA。 用合适的酶切割上述两者,产生匹配的末端。 连接酶将目的基因装入载体。 转入细菌。 筛选具有抗药性克隆。 4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR) PCR 的基本原理 体外高效、快速、特异地扩增目的基因或DNA片段的技术。 其原理类似于DNA的体内复制,只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件——模板DNA,寡核苷酸引物,DNA聚合酶,合适的缓冲液系统和DNA变性、复性及延伸的温度与时间等,使目的DNA得以迅速扩增 DNA模板变性 与体内DNA解链过程不同,PCR中作为模板的双链DNA是通过95℃左右的高温使其发生变性,形成单链DNA 模板与引物退火 PCR通常需要两条寡核苷酸链作为DNA合成时的引物(primer),这两个引物分别与待扩增模板DNA的目标片段两端的序列互补。在降低温度的过程中,通过控制退火条件,引物就能准确地与扩增区域的两端配对。 ⑴引物短,不易缠绕; ⑵设计的引物是与模板DNA两端序列互补; ⑶引物的量远大于模板分子的量,引物与模板DNA形成双链的几率远远高于DNA分子自身的复性。 引物延伸 在PCR反应体系中的DNA聚合酶,能够催化反应体系中游离的单核苷酸(dNTPs)由引物5→3方向,按碱基配对的原则延伸,形成两条与模板DNA互补的复制链。 热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环 每一循环后的模板均比前一循环增加1倍。理论上讲,扩增DNA产量是呈指数上升的,即n个循环后,产量为2n拷贝。而实际上,PCR的扩增倍数为(1+X)n,X为扩增效率,平均为75% 尽管PCR扩增DNA非常有效,但目的DNA序列的指数扩增并不是一个无限制的过程。 在正常的反应条件下,经30次循环之后,酶的催化反应趋于饱和,就会出现平台效应 (Plateau) ,产物的量不再增加。 “平台效应”出现的迟早还取决于酶的性能、模板DNA的拷贝数、dNTP浓度等多种因素。 3. 同聚物加尾连接 同聚物加尾连接是利用同聚物序列,如polyG与poly C之间的退火作用完成连接。 在末端转移酶作用下,在DNA片段末端加上同聚物序列,如将poly(dC)加到双链DNA片段3 羟基上,而将poly(dG)加到质粒载体3 羟基上,制造出粘性末端,然后进行粘性末端连接。 4. 人工接头连接 接头(linker)是指人工合成的一段双链寡核苷酸,其中包含一个(或两个)酶切位点。首先将接头与目的DNA片段进行平末端连接,继而用适当的内切酶将接头部位切出粘性末端,最后与载体进行粘性末端连接。 (四)重组体导入受体细胞 在分子克隆中,将质粒或以它为载体构建的重组分子导入受体细胞的过程称为转化(transformation)。 以噬菌体和真核病毒作载体构建的重组分子导入受体细胞的过程称为转染(transfection)。 基因片段(特别是纯化的DNA)很难直接导入受体细胞,通常将受体细胞预先加以处理,使其提高基因导入细胞的效率。例如用低温CaCl2(冰浴)处理大肠杆菌,可以大大提高质粒的转化效率。这种经过预处理的、容易导入外源核酸分子的受体细胞被称作“感受态细胞”(competent cell)。 (五)重组体的筛选 通过转化、转染等方式,重组体DNA分子被导入受体细胞,经适当涂布的培养基培养得到大量转化子菌落或转染噬菌斑。因为每一重组体只携带某一段外源基因,而转化或转染时每一受体菌又只能接受一个重组体分子,所以设法将众多的转化菌落或噬菌斑区分开来,并鉴定哪一菌落或噬菌斑所含的重组DNA分子确实带有目的基因,即可得到目的基因的克隆,这一过程即为筛选(screening)。 根据载体体系、宿主细胞特性及外源基因在受体细胞表达情况不同,可采取不同的筛选方法。 1.直接筛选法 (1)抗药性标志筛选 (2)标志补救 (3)分子杂交法 2.非直接筛选法 免疫学方法 抗药性标志筛选 如果克隆载体携带有某种抗药性标志基因,如Ampr或Tetr,转化后只有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该抗生素的培养板上生存并形成菌落,这样就可将转化菌与非转化菌区别开来。 如果重组DNA时将外源基因插入标志基因内,如插入Tetr内,使标志基因Tetr失活,阳性重组子则不能在含有Tet的培养板上生长。用插入失活筛选的重组子载体往往带有另一个抗生素抗性基因如Ampr,因此可以通过双抗生素对照筛选,即阳性转化子可以在含Amp的培养板上生长而不能在含Tet

文档评论(0)

laolingdao1a + 关注
实名认证
内容提供者

该用户很懒,什么也没介绍

1亿VIP精品文档

相关文档