激光共聚焦技术检测热盐水致大鼠萎缩性胃炎胃黏膜组织细胞HSP及Fas蛋白表达.docVIP

激光共聚焦技术检测热盐水致大鼠萎缩性胃炎胃黏膜组织细胞HSP及Fas蛋白表达710003陕西西安市中心医院消化科? ?? 摘 要 目的：研究热盐水灌胃导致的大鼠萎缩性胃炎（CAG）胃黏膜组织细胞HSP及Fas表达状态，以探讨CAG发病机制及长期热咸饮食与慢性萎缩性胃炎发生的关系。方法：采用热盐水灌胃建立大鼠萎缩性胃炎动物模型，选取大鼠胃窦及部分胃体组织行激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)标本制备，并对组织细胞结构的变化进行动态观察。结果：正常组胃黏膜组织细胞未见阳性表达，热盐水组在第12周，在细胞浆中可见HSP及Fas表达，呈均质颗粒状，第24、32及65周时表达更加明显，双标记中可见HSP和Fas共同表达。结论：热盐水长期灌胃可导致胃黏膜出现萎缩，HSP和Fas表达增加，激光扫描共聚焦显微镜检测技术具有分辨率高、灵敏度高等特点，为细胞和组织内部超微结构的研究提供了新的技术和方法。? 关键词 热盐水 胃黏膜 HSP Fas 免疫荧光 激光扫描共聚焦显微镜? 资料与方法? 一般资料：7周龄健康、性成熟的雄性SD大鼠（由第四军医动物实验中心提供）64只，体质量200～250g，随机分为3组，即正常喂养组、正常对照组和热盐水组，每组各20只。采用架式笼养，恒温24±1℃，湿度50%～60%。? 大鼠萎缩性胃炎模型的制作：正常喂养组为正常喂养，饮白开水；正常对照组为25℃白开水灌胃，每次2.5ml，1次/日；热盐水组为55℃ 15%盐水灌胃，每次2.5ml，1次/日。实验开始，先处死4只正常组大鼠，并留取胃大体标本作为对照。以后各组分别于4、8、12、24、32、65周各随机取4只，以观察黏膜萎缩情况。? 免疫荧光及激光扫描共聚焦显微镜检测技术：按身体质量与给药容积比值为0.5%，腹腔注射戊巴比妥麻醉。取出鼠胃，沿大鼠胃小弯条状取材，包括胃窦及部分胃体，做组织切片。胃黏膜组织bcl-2和COX-2蛋白表达采用激光共聚焦免疫荧光双标方法。所需仪器（荧光显微镜、恒温箱、荧光分光光度仪、电镜、共焦镜等）由第四军医大学提供，免疫荧光双标记检测试剂盒由武汉博士德公司提供。? 具体步骤：将组织切片在二甲苯中浸3次，每次10分钟；脱蜡后切片依次浸入1000ml/L、 950ml/L、700ml/L梯度乙醇中脱二甲苯，每次2分钟；至蒸馏水中浸5分钟，0.01mol/L的PBS振洗3次，每次5 分钟；正常山羊血清封闭，37℃，30 分钟。分别滴加 1：1混合的兔抗大鼠Fas(1:100)和小鼠抗大鼠HSP70(1:200)，设空白对照（无一抗，加PBS）和抗体特异性对照（加一抗不加二抗，加二抗不加一抗），所有切片同时染色。切片加入一抗后，置于湿盒内，4℃过夜；取出后37℃复温60 分钟，0.01mol/L PBS振洗3次，每次5 分钟；免疫荧光双标记分别滴加 1:1混合的FITC标记的羊抗小鼠IgG和罗丹明标记羊抗兔IgG，37℃，40 分钟；0.01mol/L PBS振洗3次，每次5 分钟；10%缓冲甘油封片。? 激光扫描共聚焦显微镜观察：所用LSCM的型号为MRC-1024，装有Zeis100显微镜，用于FITC的激发波长为488nm，568nm用于激发Texas Red，用于图像采集的显微镜物镜为Plan-Neofluar 40倍油浸镜，数值孔径（NA）为1.3，图像存为512×512像素类型，焦距值设为1.0，若需要更大的放大倍数时，可以选择更大的焦距值范围，扫描所用的激光值依据样本不同可以在共聚焦系统提供的梯值中选择。? 结 果? 激光共聚焦显微镜观察显示：正常组胃黏膜组织细胞未见阳性表达，热盐水组在第12周，在细胞浆中可见HSP和Fas表达，呈均质颗粒状，到24、32及65周时表达更加明显。双标记中可见HSP和Fas共同表达。? 讨 论? 研究认为，慢性萎缩性胃炎的病理形成主要是各种致病因素的长期刺激或继发的宿主炎症反应，导致胃黏膜深层损害和腺体破坏，使胃黏膜不能完全修复再生，从而形成胃黏膜腺体萎缩和（或）肠化生。慢性萎缩性胃炎与胃癌发生密切相关，被列为胃癌前状态。? 本研究采用激光扫描共聚焦显微镜检测技术对胃黏膜上皮组织细胞HSP和Fas等蛋白进行了双标记表达，利用计算机控制及图像处理技术，实现图像的优化、三维重建和时空的程序控制，从而得到了细胞内部超微结构的荧光图像，其分辨率比以往光学成像的分辨率高出30%～40%，灵敏度高，为细胞和组织内部超微结构的研究提供了新的技术和方法。? 参考文献? 1 郭建成,张学庸,杨云生,等.热休克蛋白在人胃癌中呈过度表达.癌症,1999,18:45-46.? 2 乔绘红,赵枚,袁兴华,施一江,周纯,范云霞