猪鼻黏膜作为鼻腔给药离体实验用黏膜可行性实验探究.docVIP

猪鼻黏膜作为鼻腔给药离体实验用黏膜可行性实验探究摘要：目的：以水蛭素为模型药物。考察猪鼻黏膜作为鼻腔给药离体实验用黏膜的可行性。方法：以同位素示踪法标记和测定水蛭素，采用Valia―Chien水平扩散池法，以兔鼻黏膜作对照。计算猪鼻黏膜和兔鼻黏膜的累积渗透量和渗透系数。结果：离体猪鼻黏膜与离体兔鼻黏膜比较，渗透系数无显著性差异(P0.05为差异无显著性意义。 2　实验方法 2.1　水蛭素的标记与测定方法 2.1.1　I－水蛭素的制备　标记：取涂有Iodogen(5ug)的反应小试管，依次加入水蛭素溶液50ul(1.0mg／mL)，NamI溶液2―4uL(18CBq／mL)，室温条件下搅拌反应5min后，加入0.5mL0.01mol／L pH7.4的PBS缓冲液终止反应。标记反应接近5min时，马上取样，用快速硅胶簿层层析纸(rrI／SG)法分析标记率。本阶段共进行用于动物试验的6次正式标记，其标记率有时可达30％－75％。 纯化：以上反应液立即用Sephadex G―15层析柱(1cmx30cm)进行纯化，洗脱液为0.01mol／L pH7.4的PBS缓冲液，流速lmL／min。收集洗脱液(1mL／管)并依次测量各管的放射性量，合并收集到的。I－水蛭素(第10－13管)。 2.1.2　标记物放射性化学纯度鉴定标记物放射性化学纯度由上海复旦大学放射医学研究所鉴定，鉴定结果：放射性化学纯度都95％，合格，可用于动物试验。 2.1.3　三氯乙酸沉淀法(TCA分析法)　100UL含有放射性样本于小离心管中，直接加入1.5mL 3％TCA水溶液，混匀后，3500r／min离心5min，吸去上清液，测量TCA沉淀的放射性计数(cpm)。计算时要经过游离碘的共沉淀和回收率的校正，方可认为酸沉淀物的放射性含量就是125I标记物的含量。 2.1.4　硅胶薄层层析纸法(ITLC／SC法)　以快速硅胶薄层层析纸(ITLC／SG)为载体，用85％乙醇展开后，将每条层析纸剪成1cm等距离的小条，放入放射性测量试管中进行测定125I－水蛭素的放射性化学纯度。 2.1.5　结果　用y计数器测量样品的放射性计数(cpm)，然后换算成样品中相应的水蛭素含量。 2.2　Valia－Chien水平扩散池法 2.2.1　鼻黏膜的制备将死亡2h内的动物的鼻部取下，切开鼻腔，暴露出鼻中膈及两侧鼻甲骨，用一圆头细玻棒及镊子将覆盖在其上的鼻腔黏膜小心剥离，用生理盐水洗净黏膜上残留的血迹，再将其平铺在铝箔上，置70℃低温冰箱冷冻储藏，在1周内用掉。 2.2.2　Valia―Chien扩散池安装渗透实验操作采用Val.ia Chlen扩散池，由两个半池组成，一为供给池，一为接受池。容积均为5mL，扩散面积0.785cm2。两半池的外侧分别有夹层，和外界恒温水浴相联，以保持池内药液的温度为37℃，两半池内分别放一搅拌子，底部放有磁力搅拌器，以100r／min速度搅拌，以保持池内药液混合均匀，通o2并调节气流量。 2.2.3　操作实验开始后，在两半池中央放一块鼻黏膜，浆膜朝向接受池。供给池加入放射性浓度为17.6MBq／mL的125i－Hirudin生理盐水溶液供试药液5mL，分别在0、5、15、30、60、90、120、180、240rain从接受池中取样800uL。立即补加等量新鲜生理盐水。 2.2.4　Valia―Chien扩散池实验数据处理方法计算单位面积累积渗透量Q，以不同时间的Q对时间t作图，该图的直线部分斜率即为稳态透过速率Js，以渗透速率J8除以供给池药物起始浓度co，即得渗透系数kp。 以不同时间的Q对时间t作图，该图的直线部分斜率即为稳态透过速率Js。 Kp=Js／co 其中，Kp：渗透系数；A：扩散池横截面积；V：接受池中接受液体积；co：供给池中供试药物浓度。 3　实验结果 3.1　兔和猪离体鼻黏膜比较实验 取猪鼻黏膜和兔鼻黏膜，2.2实验方法，在规定的各时间点取样800uL，计算累积渗透量和渗透系数，结果见表1、表2。从5min取样时间开始，以不同时间点的累积渗透量对相应的时间作图，见图1。 结果表明，猪和兔的鼻黏膜在4h内对药物的渗透系数和累积渗透量无明显区别(P0.05)。 3.2　鼻黏膜的不同部位对125I―Hinldin透过性影响 分别取猪鼻中隔和鼻甲部位黏膜，分成两组。用2.2实验方法，在规定的各时间点取样，测定cpm，计算累计渗透量和渗透系数，结果见表3、表4。从5mln取样时间开始，以不同时间点的累积渗透量对相应的时间作图，见图2。 结果表明：鼻甲部位猪离体鼻黏膜对模型药物渗透系数大于鼻中膈部位