肝纤维化不同证型及TGF-β1-Smad基因蛋白表达关系实验探究.docVIP

肝纤维化不同证型及TGF-β1/Smad基因蛋白表达关系实验探究摘 要:目的:观察肝纤维化不同证型与TGF-β1/Smad基因蛋白的关系。方法:分别设立正常对照组、单纯肝纤维化组、肝纤维化肝郁脾虚证组和气虚血瘀证组,各模型组先用CCl?4注射法复制肝硬化疾病模型,然后肝郁脾虚证组附加夹尾和大黄灌胃法、气虚血瘀证组附加游泳疲劳法,并以相应药物干预。采用免疫组化法测定肝组织TGF-β1、TβR-Ⅰ、Smad2/3及Smad7水平,用比色法测定肝组织Smad3mRNA。结果:TGF-β1、TβR-Ⅰ、Smad2/3和Smad7在模型对照组中表达明显增强,以肝纤维化气虚血瘀组最为显著,肝纤维化肝郁脾虚组和单纯肝纤维化组的表达面积和强度相似。各模型组Smad3mRNA呈上调表达,差异均具有十分显著的意义(P0.05)。 2.2 中药干预后各组比较 2.2.1 TGF-β1 TβR-Ⅰ Smad2/3和Smad7在肝脏的表达分布特点 经延长3周造模后,单纯肝纤维化组、肝纤维化肝郁脾虚、气虚血瘀阴性对照组上述指标表达的面积和强度均增强,以气虚血瘀阴性对照组增强最明显(见图15～26)。 病证结合治疗组经相应药物治疗后上述指标表达的面积和强度均减弱(见图27～34)。 2.2.2 各实验组肝组织TGF-β1 TβR-Ⅰ Smad2/3和Smad7蛋白表达的比较 表5所示,9周时与正常对照组比较,各组TGF-β1、TβR-Ⅰ、Smad2/3和Smad7表达的面积和强度均增强(P0.05)。结果见表5。 3 讨 论 3.1 TGF-β1/Smad基因蛋白与肝纤维化的关系 TGFβ-Smad信号转导通路与肝纤维化的发生发展关系非常密切。本实验发现,各模型大鼠肝纤维化时肝脏TGF-β1、TβR-Ⅰ、Smad2/3的表达明显高于正常组的表达,提示肝纤维化时TGF-β1信号转导异常活跃,TGF-β1信号转导体系在细胞外、细胞膜、细胞内3个层次均发生了巨大的变化,这种纵向体系整体的变化可能正是肝纤维化发生发展的更深层次的原因。另外,免疫组化定位研究显示,TGF-β1、TβR-Ⅰ、Smad2/3的表达位置有一定同一性,它们在正常组均弱表达在肝窦Dissee间隙、汇管区和中央静脉周围细胞,肝细胞中未见表达,提示上述3种蛋白分子都参与了正常肝脏的生理活动,而且主要作用部位在非实质细胞而非肝细胞;在模型组,TGF-β1、TβR-Ⅰ、Smad2/3三者在纤维间隔、汇管区和中央静脉周围都有强阳性表达,而在肝细胞胞浆内均有弥漫的弱阳性表达,提示肝纤维化时ECM中以HSC为主要细胞的细胞群TGF-β1的信号转导剧烈而活跃进行,是推动肝纤维化进展的主要动力,而且肝细胞本身也存在TGF-β1的信号转导,在肝纤维化过程中发挥着一定的促进作用。目前认为,TGF-β1对HSC的作用信号主要通过其受体和下游信号分子Smads蛋白转导,其中以Smad3为代表的R-SMAD分子传递的可能是致肝纤维化信号,以Smad7为代表的I-SMAD分子携带的可能是抗肝纤维化信号[11]。本实验发现肝纤维化模型组具有促纤维化作用的Smad2/3表达增加,其增加与减少程度与肝纤维化水平呈正相关,Smad2/3大量磷酸化及随后Smad复合物在核内的信号传导,直接介导HSC向肌成纤维细胞(Myofibroblast Cell,MFB)的转化,激活血纤维蛋白溶酶原激活剂抑制因子-1(plasminogen activator inhibitor type-1,PAI-1)和α2(Ⅰ)前胶原转录,导致纤维化逐步加重。本实验发现Smad7在造模6周时与Smad2/3同步升高,提示Smad7与Smad2/3之间相互制约。纤维化启动及进展过程中Smad7被磷酸化,通过特异性地与活化的TβR-Ⅰ的胞内区结合,抑制Smad2/3蛋白的磷酸化,起到抑制TGF-β1信号转导作用。 另外,对肝纤维化模型大鼠肝脏TGF-β1、TβR-Ⅰ、Smad2/3三者的相关性研究结果显示,模型组TGF-β1、TβR-Ⅰ、Smad2/3之间均有显著的正相关关系,提示在肝纤维化时TGF-β1、TβR-Ⅰ和Smad2/3之间存在明显的协同性,这种协同效应可能是TGF-β1信号转导过程不断放大和其促肝纤维化效应实现的条件之一;正常组各指标之间无有意义的相关性,笔者推测这种没有相关性的表达可能正是正常肝脏不发生肝纤维化的条件之一。而模型组大鼠肝纤维化分级与TGF-β1、TβR-Ⅰ、Smad2/3之间有着显著的正相关性,提示肝纤维化时,TGF-β1、TβR-Ⅰ、Smad2/3的表达,或TGF-β1的信号转导强度,与肝脏ECM的沉积有着更加明显和更加直接的关系。而Smad7与TGF