胎兔皮肤无瘢痕愈合相关蛋白筛选及初步研究.docVIP

胎兔皮肤无瘢痕愈合相关蛋白筛选及初步研究李　杨 [摘要]目的：筛选胎兔皮肤组织无瘢痕愈合相关蛋白，并初步分析其在无瘢痕愈合过程中的作用。方法：建立胎兔背部切割伤模型，运用蛋白质组双向电泳技术筛选胎兔皮肤伤后差异表达的蛋白质，并进行质谱和数据库检索分析。结果：筛选出20个在伤后胎兔皮肤组织中特异高表达的蛋白质点，经过质谱和数据库检索分析后确定：伴侣素或线粒体蛋白P1前体、弹性蛋白(Vi－mentin，Vim)、微管蛋白β多肽、核不均一核糖核蛋白H(异质性胞核核糖核蛋白H)、α烯醇酶(α－磷酸丙酮酸水合酶)等无瘢痕愈合相关蛋白在胎兔皮肤伤后表达增加。结论：上述无瘢痕愈合相关蛋白可能通过对基因转录和翻译的调控，促进胶原蛋白等的合成和正确的折叠、装配，以及促进细胞的增殖、分化和发育等，促进胎兔皮肤创伤的修复，参与其无瘢痕愈合过程。 [关键词]胎兔；皮肤；无瘢痕愈合；创伤：蛋白质组；基质辅助的激光解析电离／飞行时间质谱 [中图分类号]R641　Q591．2　R751　[文献标识码]A　[文章编号]1008―6455(2007)01―0011－04 自Burrington首次发现胎儿皮肤创伤后修复无瘢痕形成，并确立了“无瘢痕愈合”(Scarless Healing、Scar-free Healing)的概念以来，“无瘢痕愈合”模式成为人们孜孜以求的理想，但至今胚胎个体“无瘢痕愈合”的具体机制还不清楚。我们在前期的研究中发现在胎兔皮肤创伤无瘢痕愈合过程中确有基因表达的差异存在，且差异表达基因可能在其过程中具有重要的作用。而基因最终是通过蛋白质的表达才发挥其功能，本实验运用双向电泳技术，筛选胎兔皮肤无瘢痕愈合相关蛋白，并进行初步分析。 1　材料和方法 1．1动物与试剂：健康雌性大耳白兔20只，体重(3．0～3．5)kg(第三军医大学大坪医院动物中心)，“速眠新”合剂(长春农牧大学兽医研究所)，哺乳动物总蛋白提取试剂盒(Merck公司)，pH4-7、11cm固相pH梯度(Immoblilized pH gradient，IPG)预制胶条(Bio-Rad公司)，银染增强型试剂盒(Bio-Rad公司)。 1．2动物致伤与分组：对20只妊娠20天的雌兔进行麻醉后，无菌条件下对胎兔背部致切割伤，伤后继续饲养。以20只致伤胎兔作为创伤(Fetal trauma，FT)组，20只同胎未致伤胎兔作为对照组(Fetal control，FC)，20只妊娠兔作为成年创伤对照(Adult trauma control，A7C)组。于伤后24h分别取各组兔伤口处皮肤组织。 1．3总蛋白质提取：用哺乳动物总蛋白提取试剂盒提取兔皮肤组织的总蛋白，并用Bradford法测定其浓度。 1．4胎兔皮肤蛋白质组双向电泳：采用pH值范围4～7、长11cm的IPG胶条进行双向电泳。被动水化；第一向等电聚焦：电压8000V，总聚焦60000Vh：第二向十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS)：分离胶采用10％的丙烯酰胺凝胶，分离胶电流30mA／gel，电泳凝胶用硝酸银染色的方法进行染色。 1．5差异蛋白质点选取及初步分析：相同条件下分别对FT、FC、ATC三组兔皮肤总蛋白进行三次双向电泳。凝胶图谱用ImageMaster 2D Platinum图像分析软件分别进行分析，并对三组样品电泳凝胶进行差异比较分析。 对F7组特异高表达差异蛋白质点进行基质辅助的激光解析电离／飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrogram，MALDI-TOF-MS)分析，得到各蛋白点的肽指纹图谱，然后将肽指纹图谱进行数据库检索，分析其功能。 2　结果 2．1动物模型：成年雌兔均健康存活；致伤胎兔死亡4只，存活16只，手术成功率80％；对照胎兔均成活。 2．2皮肤组织总蛋白质：各组样品组织总蛋白浓度分别为：F7组(3．22～4．44)μg/μl、FC组(3．12～4．62)μg/μl、ATC组(16．54～18．96)μg/μl，各组样品总蛋白量分别为：FT组(3886～4664)μg、FC组(3880~4862)μg、ATC组(12432～14226)μg。 2．3总蛋白质双向电泳及无瘢痕愈合相关蛋白的筛选：胎兔致伤组3张电泳图谱上分别检测到91个、107个和117个蛋白质斑点，平均蛋白质点(105±14)个；胎兔对照组分别检测到89个、107个和127个蛋白质斑点，平均蛋白质点(108+1