骨髓基质细胞培养及保存方法.docVIP

骨髓基质细胞培养及保存方法摘 要 目的：建立大量生产骨髓基质细胞的培养和保存方法。为组织工程骨的培养提供种子细胞。方法：从4～5月龄新西兰大白兔胫骨上端髓腔抽吸骨髓，接种、培养及液氮冻存。通过显微镜观察其生物学表现，测定碱性磷酸酶，鉴定其生物学特征。结果：在培养过程中，未分化的骨髓基质细胞选择性粘贴于培养皿底，形态为成纤维细胞样，并呈集落生长。培养值至9～10天时，贴壁细胞单层融合。传代后的细胞形成集落的趋势明显下降，但细胞形态仍表现为成纤维细胞样，复苏细胞贴壁时间延迟，但增殖速度和形成没有改变。可测出碱性磷酸酶活性。结论：成功地建立了骨髓基质细胞的培养和冻存方法。 关键词 组织工程 骨髓基质细胞 细胞培养 细胞冻存 材料与方法 骨髓基质细胞的分离，取4～5月龄新西兰大白兔，3%戊巴比妥钠耳缘静脉缓慢注射麻醉。抽吸部位为胫骨上端，剪除兔毛，无菌操作下切开皮肤至干骺端，剥离开骨膜（防止其他细胞或杂物混入）。骨穿针穿入骨髓腔，用含有0.1ml肝素（3000U/ml）的5ml的注射器负压抽吸骨髓液2ml，颠倒混匀。骨髓液用PBS溶液洗涤3次后，加入amF12培养液至10ml悬浮。然后将此细胞悬液缓慢加入盛有淋巴细胞分离液的离心管中（细胞悬液与分离液之比为2∶1），离心（350～400g，20～30分钟）。吸出分离液的乳白色细胞层（单核细胞层），加适量PBS离心（180g，5分钟）洗涤细胞，用血细胞记数器记数有核细胞，0.4%台盼蓝染色证实细胞活性。 骨髓基质细胞的培养：①原代培养：分离的单核细胞或抽吸的骨髓液PBS溶液洗涤1次后，用amF12培养液悬浮，按所需的细胞密度接种在各种培养板中，置于二氧化碳细胞培养箱中（37℃、5%CO2）持续培养。②传代培养，贴壁的成纤维细胞样细胞增殖接近融合时，用1mM EDA和0.25%胰蛋酶消化。分散悬浮的细胞以1×104/cm2密度接种在100mm塑料培养皿中，持续培养1周后再传代。 骨髓基质细胞的冻存和复苏：消化分散贴壁细胞后，PBS洗涤，离心（1500rpm，5分钟），弃上清。然后重复悬浮于amF12培养液中，记数细胞。将细胞悬液和无菌二甲基亚砜（DMSO）溶液混合［DMSO的最终浓度为10%(V/V)］。装入生物低温管封存密封后，置低温冰箱内-80℃冻存。将细胞冻存管从冰箱中取出，立即置于37℃水浴中，融化后，amF12培养液洗涤，离心。然后加入amF12培养液培养。 碱性磷酸酶（ALPase）的分析：将传代培养的第二代骨髓间充质细胞按1×104/孔的细胞密度用amF12培养液悬浮并接种于96孔培养板中。当细胞长满形成单层后，更换含有2%小牛血清的amF12培养液，同时添加各种浓度的地塞米松，继续培养24小时。保温结束后，更换含10%小牛血清的amF12培养液继续培养，此后隔日换液。根据Bessey的方法测定ALPase。细胞层用冷PBS（p7.4）冲洗3次，加入0.5ml0.9%Nacl/0.2%ritonX-100，在冰水浴中用玻璃匀浆器制成匀浆，在4℃离心（12 000g，15分钟），上清用于ALPase活性测定。样品与反应液（0.5Mtris-CL，p9.0/0.5mM对硝基苯磷酸二钠(para-Nitrophenyl phosphate，PNP)/0.5mM氯化镁)在37℃保温15分钟或30分钟。用0.25倍体积的1MNaO终止反应。然后在波长410nm下测定吸光值，以对硝基苯酚做标准参照。 结果 原代培养：骨髓中含有许多细胞，骨髓间质细胞的含量少，体外培养时呈贴壁生长，其它细胞则不贴壁生长或逐渐死亡，随换液而除掉。我们发现：培养后4小时，细胞开始贴壁。24小时后，贴壁细胞明显增多，圆形的细胞变形伸出伪足，呈成纤维细胞外观。培养至第5天，更换培养液。见贴壁的成纤维细胞呈集落生长，集落较小、形态基本一致。培养至第7～9天形成明显的集落（多于50个细胞），第9～10天，单层生长接近融合。细胞接种时密度越大，则形成的集落越多，集落体积越大。这可能有三方面的原因：细胞本身分泌的自分泌因子促进生长，贴壁细胞在接种细胞中比例小而不相互抑制，贴壁细胞相对增多。 传代培养：传代培养的细胞在接种后4小时开始贴壁，6天左右长满单层接近融合。我们发现：传代后的细胞形成集落的趋势明显下降，但细胞形态仍表现为成纤维细胞样。经6次传代后，细胞数量已扩增至原来的5000倍左右。（表１） 细胞的冻存和复苏：将冻存的复苏的细胞接种于塑料培养基中，16小时才有部分细胞贴壁。但在培养后7～8天细胞长满单层接近融合。贴壁细胞形态仍为成纤维细胞样。由此可见贴壁复苏细胞贴壁时间延迟，但增殖速度和形态没有改变。 碱性磷酸酶活性：在有地塞米松存在的情况下，骨髓间