分光光度分析电化学分析及自动化技术.DOC

第五章 常用生物化学检验技术 临床生化检验常用的分析技术有光谱分析技术、电化学分析技术、电泳分析技术、层析和离心分析技术及自动化分析技术。其中光谱分析技术是最基本和最常用的技术，它具有灵敏、准确、快速、简便、选择性好等特点而被广泛应用。 第一节 光谱分析技术 光谱技术是根据物质吸收或发射辐射能而建立起来的一类分析方法，因不同分子的原子团和原子，其发射光谱和吸收光谱不同，而相同的物质在一定条件下，其发射光谱和吸收光谱的强度与该物质的含量成正比关系。因此可对物质进行定性和定量分析，此类技术称为光谱技术。是一种最常用的生化检验测定技术，它主要包括吸收光谱（可见紫外、红外原子吸收光谱法）、发射光谱（荧光法、火焰发射光谱法）和散射光谱（比浊法）。光是一种高速传播的电磁辐射，具有波、粒二象性，光的波长（λ）的常用单位纳米（nm），可见光波长400～760nm，＜400nm称为紫外光，＞760nm称为红外光，波长愈短，能量愈大。 可见，紫外吸收光谱是由于多原子分子的价电子在电磁辐射的作用下，由基态跃迁到激发态，这种因物质分子对辐射的选择性吸收而得到的光谱称为吸收光谱。 处于高能态的分子（激发态分子）是不稳定的，当返回基态时，便发射出相应的光谱，称为发射光谱。 可见，紫外吸收光谱用于定量分析的依据是光的吸收定律，即Lambert-Beer是律，它是吸收光谱法的基本定律。 一、分光光度法的基本原理 （一）吸光度与透光度 当光线通过均匀、透明的溶液时，一部分光被散射，一部分光被吸收，另一部分光透过溶液。设入射光强度为Io，透射光强度为It，It与Io之比称为透光度（T），即 T常用百分数表示（T%），也称为百分透光度。 透光度的负对数称为吸光度（A），又称为消光度（E），光密度（OD），即 吸光度与透光度的换算： 如透光度=10％时 A = lg100－lg10 = 2－1 = 1 透光度=20％时 A = lg100－lg20 = 2－1.3 = 0.7 （二）Lambert-Beer定律 1. Lambert定律 当一束强度为Io的单色光透过某种吸光溶液后，由于溶液吸收了一部分光，则透过的光线为It。当溶液浓度不变时，透过的液层愈厚，则光线强度的减弱愈显著。 吸光度随液层厚度增加而增加，其关系是吸光度（A）与液层厚度成正比，即 将上述比例式写成等式，则引入比例常数，即吸光系数（K），得A = K·L 当溶液浓度不变时，吸光度与液层厚度成正比，这就是Lambert定律。 2. Been定律 当一束强度为Io的单色光透过某种吸光溶液后，若液层厚度不变，而浓度不同时，溶液的浓度愈大，则透过光的强度愈弱，其定量关系是： 当液层厚度不变时，吸光度与溶液浓度成正比，这就是Beer定律。 合并Lambert定律和Beer定律 即Lambert-Beer定律 是说明吸光物质对单色光吸收的强度与该物质的浓度和液层厚度成正比。 溶液的吸光强度与浓度的关系，如用坐标表示，即 A-C曲线 呈正比 易制图，使用方便 （三）吸光系数 吸光系数K的物理意义是吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸光度，在给定条件下（波长、溶液性质、浓度）吸光系数是物质的特征常数，K值愈大，能测定的浓度C愈小，则灵敏度愈高。 吸光系数的表示方法 1. 摩尔吸光系数 用 表示，其意义是浓度为1mol的溶液在厚度为1cm时的吸光度。 2. 百分吸光系数 或称比吸光系数，用表示，是指浓度为1％（W/V）的溶液在厚度为1cm时的吸光度。 换算关系： 二、分光光度计的基本结构 分光光度计由光源、单色光器、比色杯、光电管、运算放大器和显示器等部分组成。 1.光源 2.单色光器 3.试样室 4.光电管 5.运算放大器 6.显示器 图5-1 分光光度计结构示意图 （一）光源 可见光分光光度计常用光源是钨灯，能发射出350nm～2500nm波长范围的连续光谱，适用范围是360nm～1000nm。现常用的是卤钨灯，发光效率提高，使用寿命延长。 紫外分光光度计常用光源是氢灯，其发射波长范围为150nm～400nm。 （二）单色光器 将光源的复合光分散为单色光的装置称为单色光器。常用的单色光器有滤光片、棱镜和光栅。 （三）比色杯 盛放比色溶液的装置。用无色透明、耐腐蚀、耐酸碱的玻璃或石英材料做成。光径有0.5～5cm，比色杯间的透光度误差应小于0.5%。 （四）检测器 由光电管和运算放大器组成，是将光信号转换成电信号，并将电信号放大的装置。 （五）显示器 是将检测器所检测的电流通过仪表显示出来的装置。常用的有检流计和数字显示器。检流计可显示透光度（T%）和吸光度（A），数字显示器可显示T%、A和C（浓度）。 三、分光光度法的定量方法