实验四、sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量.pptVIP

实验四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量 一、实验目的 学习SDS测定蛋白质分子量的原理。 掌握垂直板电泳的操作方法。 运用SDS测定蛋白质分子量及染色鉴定。 二、实验原理 带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。 区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。 支持介质的作用：防止机械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。 聚丙烯酰胺凝胶的聚合反应 单体：丙烯酰胺（Acr） 交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis） 催化剂：过硫酸胺 加速剂：四甲基乙二胺（TEMED） 产物：三维网状结构的凝胶 PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类。 连续电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应分离。 不连续电泳系统中缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度具有不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，所分离条带清晰度及分辨率较好。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）。 SDS与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。SDS-蛋白质复合物的形状近似于长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，而长轴则随蛋白质相对分子质量成正比变化。 当SDS与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有大量的负电荷，并远远超越其原来的电荷，使蛋白质分子间的电荷差别降低乃至消除。 SDS-蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，只是蛋白质相对分子质量的函数。 当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：lgMW=K-bX 式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量时，只有完全打开二硫键，蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。因此在用SDS处理样品同时往往用巯基乙醇处理，使被还原的二硫键不易再氧化，使很多不溶性蛋白质溶解而与SDS定量结合。 有许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的，在SDS和巯基乙醇作用下，解离成亚基或单条肽链，因此这一类蛋白质测定时只是它们的亚基或单条肽链的分子量。 已发现有些蛋白质不能用SDS测定分子量。如电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（某些糖蛋白）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。 一般至少采用两种方法测定未知样品分子量，互相验证。 三.实验试剂和器材 2.实验试剂 （7）2×SDS上样缓冲液： 0.4g SDS， 20mg溴酚蓝， 2mL甘 油，1mL 1M Tris-HCl（pH8.0）， 20μL 巯基乙醇，定容至10mL。 （8）SDS电泳缓冲液（25mM Tris，0.25M甘氨酸， 0.1%SDS，  pH8.3）：称Tris3.02g，甘 氨酸18.8g，加入SDS 1g，加蒸馏水使其 溶解后定容至1L。 （9）染色液：称考马斯亮蓝R250 0.25g，溶于227mL蒸馏水，227mL甲 醇，46mL冰醋酸的混合液中，过滤后备用。 （10）脱色液：冰乙酸100ml，乙醇50ml，加蒸馏水850mL，混匀。 （11）银染固定液。10%冰乙酸溶液。 （12）银染溶液。0.1%硝酸银溶液100 mL，使用前加37%甲醛0.5 mL。 （13）显影液。3%碳酸钠溶液200 mL，使用前加硫代硫酸钠0.8 mg和37%甲醛1 mL。 3. 实验器材 垂直板电泳装置 直流稳压电源 移液管 滤纸 微量注射器 大培养皿 四、实验要求 样品1：蔗糖酶 样品2：肌酸激酶（从中华鳖肌肉中提取） 样品3：牛血清白蛋白 样品4：酪氨酸酶（从双胞蘑菇中提取） 五.实验步骤 3）迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液，留出灌注浓缩胶所需空间（梳子的齿长再加0.5cm）。再在胶液面上小心注入1mL蒸馏水以阻止氧气进入凝胶溶液。 4）分离胶聚合完全后（约30分钟），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。 6）聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。 7）在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按1:1体积比加入上样缓冲液，在100℃加热5分钟以使蛋白质变性。 8）浓缩胶聚合完全后（30分