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常用的半抗原与蛋白偶联方法简介（一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联）1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method）偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法1、5．8mg MIT用0.1ml二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。2、1.5mg酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为9.0，q然后4度过夜。4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液(pH7.5)平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA 0.1％（w/v）、NaN3 0.02%(w/v)的缓冲液中。碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤1、??取EDC 100mg , 用pH8.0的10 m mol/L PBS液2.5ml使之充分溶解（I液）2、??取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸 25mg , 用0.2mol/L NaOH 溶液2ml 溶解(II液)3、??取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （pH8.0）液中（III液）4、??将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下0.5ml）5、??室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液6、??4度搅拌12小时7、??静置10小时（4度）8、??有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法1、??用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L的溶液。2、??加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和 DCC（二环已基碳化二亚胺），200 m mol/L, 4度反应16小时。3、??用簿层扫描方法纯化(氯仿：水=9：1)4、??按孕酮/酶摩尔浓度比约为10的比例，将上述溶液加入到酶液（用pH7.4，浓度50 m mol/L的磷酸缓冲液溶解）中。5、??（二）含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤1、??用0.1 mol/L HCl溶液配制 4 m mol/L浓度的半抗原。2、??滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/L KI进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。3、??溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。4、??用pH9.0、浓度为200m mol/L的硼酸或碳酸缓冲液溶解蛋白。5、??边搅拌，边加入重氮化的半抗原（防止局部发生酸过量现象），调节pH到9.5。6、??冰箱中搅拌反应2小时，不断调节pH到9.0。7、??用PBS透析2天8、??-20度保存（浓度为20mg/mL）双功能的酰亚胺酯(imidate esters)可以氨基反应，形成脒。例如：用二甲基已二酰亚胺酯(dimethyladipimide)将去甲基三正喋呤(desmethylmortriptyline)与β-半乳糖苷酶偶联。应用双功能酰亚胺酯（imidate esters）制备去甲基三正喋呤-与β-半乳糖苷酶标记特的操作步骤1、??用含5％（W/V）N-乙基吗啉的无水甲醇0.4ml,在室温下溶解570ug去甲基三正喋呤和488ug 二甲基已二酰亚胺酯(dimethyladipimide)(A液)2、??取与β-半乳糖苷酶 100 ug, 溶于pH9.9的100 m mol/L碳酸缓冲液（含MgCl2 10m mol/L,2-巯基乙醇 10 m mol/L 0.1ml(B液)3、??将A液倒入B液。4、??20度反应90分钟后，加含NaCl 100 m mol/L, MgCl2 10 m mol/L和2-巯基乙醇 10 m mol/L、pH7.5的Tris-醋酸缓冲液(50m mol/L) 1ml, 终止反应。5、??过sephadex G-25, 去除小分子物质，得酶标记物（约75％的酶与半抗原结合，但用三正喋呤代替去甲三正喋呤(demethylmortriptyline )进行偶联，则只有15％的酶与之结合。（三）含巯基半抗原的偶联可用马来酰亚胺方法与蛋白偶联。此外，将载体蛋白用溴乙酰胺(bromoacetamide)激