编号： 生物农药工程研究中心 [2006-01-27] 共3页 承担单位：福建省农 .doc

编号： 生物农药工程研究中心 [2006-01-27] 共3页 承担单位：福建省农科院生物技术研究所 课题编号： 课题名称： 课题负责： 子课题名： 子课题号： 子课题人： 子项目名： 项目主持： 子项目-2： 试验项目：JK-2菌株胞外多糖（EPS）的提取、分离及纯化方法 的研究与应用 试验人员：张秋芳 黄素芳 朱红梅 试验负责：刘 波 设计日期：2006年1月27日polysaccharide,EPS）是指细菌在生长、代谢过程中分泌到细胞外的粘液或夹膜多糖，成分和结构复杂，具有调节和增强免疫功能、抗肿瘤、抗感染、抗炎等多种功效。 本研究参照已有的方法并结合本试验室的实际，对短短芽孢杆菌JK-Ⅱ菌发酵液的胞外多糖进行分离提取，以期建立一种能够有效提取该菌胞外多糖的方法。 Ⅰ.JK-2菌株胞外多糖的提取分离、纯化及鉴定方法的确定 试验一.JK-2菌株胞外多糖的提取分离、纯化方法一（参照福大生命科学院方法） 并对提取剂乙醇浓度梯度进行比较 试验二.JK-2菌株胞外多糖的提取分离、纯化方法二（参照参考文献） （试验一和二进行多糖提取量的比较） 试验三.提取纯度比较(在方法上进行探讨，并建立纯化多糖的柱层析方法) 方法1 紫外光谱扫描(检验280nm处是否有特征吸收峰,以确定是否有蛋白质存在) 方法2 纸层析[3] 方法3 凝胶柱层析,用自动部分收集器收集（Sephadex G-200 1.5X70cm 洗脱液0.05NNaCl,用酚-硫酸法）[3]或(Sephadex G-100 1.5X30cm 洗脱液0.1NNaCl用蒽酮法测定多糖含量) 流速比较 方法4.高效液相色谱测定（HPLC） 方法5.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 试验四.多糖提取物质的组分分析与性状鉴定（结合标准品进行试验） 方法1.红外光度计扫描，测定吸收峰 方法2.纸层析 （标准品） 方法3.薄层层析（TLC） 方法4.气相色谱（GS） 方法5.核磁共振氢谱 方法6.酶水解 方法7.酸水解 方法8 分子量的确定 9比旋光度和粘度的测定 试验五.多糖提取方法的确定与建立（总结上述试验并得出结论） Ⅱ.JK-2菌株胞外多糖的提取分离、纯化及鉴定方法的应用研究 试验六.发酵条件(C/N、起始pH值、营养元素、通气量等到)对多糖提取物的比较(可有三个试验) 试验七.生长周期(整个生长过程)的胞外多糖提取物的比较 试验八.多糖物质的对作物的冶病力及其抗逆性影响 试验一 JK-2菌株胞外多糖的提取分离、纯化方法一（参照福大生命科学院方法） 1.试验材料与方法 1.1试验设备和试剂: 1.摇床、紫外分光光度计、离心机、真空抽滤器、层析柱（1.5×30cm）、中空纤维包、透析袋 2.牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、NaCl、乙醇、异丙醇、乙酸钠、硫酸、氢氧化钠、氯仿、正丁醇、丙酮、乙醚、重蒸酚和葡萄糖。 1.2试验方法 1.2.1发酵液的制备 液体培养基配制 选用培养基SPY，其配方为：牛肉膏 0.5% 蛋白胨1.0% 酵母粉0.5% NaCl0.5%,pH7.2，配制好后高压灭菌。[1] 发酵液的制备: 将经活化后的JK-Ⅱ菌株接入150mlSPY液体培养基若干瓶,置30℃、160r/min恒温摇床振荡培养，48h后发酵液供试验用。 1.2.2多糖的提取与分离 将菌液于10000rpm下离心10min,离心后,取上清液,经中空纤维包洗脱分离后，真空浓缩(浓缩温度50℃)，加乙醇沉淀(除部分蛋白20-30%)，10000rpm下离心，取上清液，真空浓缩(除乙醇)，用异丙醇沉淀(将多糖全部沉淀下来,用50%稍高)，离心(13000rpm)取沉淀后，用稀盐液溶解沉淀NaAc0.3N，经732型强酸型离子交换树脂层析，并用洗脱液（pH2.5 用1N H2SO4调）洗脱后，用透析袋在蒸馏水中透析(置水笼头下,经自来水冲洗1-2d,第3d再用蒸馏水透析)，后冻干，贮存。 A. 试验条件优化 表1.提取液种类与浓度 提取液名称 处 理 体积浓度1(%) 体积浓度2(%) 体积浓度3(%) 乙 醇 40 50 60 异丙醇 40 50 60 B.732强酸型离子交换树脂处理与再生 先将树脂（福大生命科学院林坚老师提供）用70%乙醇浸泡，除去脂溶性物质后，用1NNaOH洗至碱性后，用蒸馏水洗至中性再用1MH2SO4洗至酸性，蒸馏水洗至中性（pH试纸颜色不变为止），洗脱液（pH2.5的稀H2SO4）洗至流出液pH与流进的一致。 1.2.3提取液糖含量的测定 将上述两种方法所获得的糖制品用溶于等体积的去离子水，用酚-硫酸法进行含量