组织中的细胞周期和凋亡检测方法之一－－PI法.PDF

组织中的细胞周期和凋亡检测方法之一－－PI 法 schoman 无论是肿瘤或其它正常新鲜组织均可用 PI （碘化丙啶）的方法来检测，这是一 种常见而且便宜的方法。主要操作步骤如下： 1、组织块用 0.25%胰酶消化 30min－1h。 2、200－400 目筛网过滤细胞，获得单细胞悬液。 3、75％乙醇（－20 度预冷）固定细胞 1h。 4、加入 PI （终浓度50ug ／ml）和无 DNA 酶污染的 RNA 酶（终浓度 50ug ／ml） 1ml 染色 30min－1h。 5、流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。 注意事项： 1、组织消化后使细胞形成单个细胞悬液是本检测方法的关键。如组织难以消化， 可加入适量胶原酶。另外，消化前，用剪刀将组织剪成小块也不要忘了。 2、细胞可尽量的多准备（at least 100 thousand），这样流式检测方便，结果 可靠。 3、每次消化的时间等条件应尽量一致，否则使实验结果 CV 值偏大。 4、细胞用乙醇固定后可以访置 48 小时（4 度保存）后检测，便于无法立即检测 的实验者，对实验结果基本没有影响。 其它也有一些检测凋亡的方法，均有商品化试剂盒。在此不赘述。 yanzishenyang：我看相关的说明：碘化丙啶（propidium iodide,PI）检测 早 期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一个重要指标，凋亡细 胞在进入最终溶解阶段前，胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的与 DNA 结合的荧光染料（如 PI）不能时入凋亡细胞内，而相对分子质量小的荧光染料 （如Hoechest 3342 或 33258 等）仍能被细胞摄取。应用流式细胞仪或荧光显微 镜可区分和坏死细胞，细胞内 DNA 出现Hoechest 3342 标记而不出现 PI 标记的 为凋亡细胞。 偶得细胞是用 PI 染色的，经过流氏细胞仪检测出现一个亚二倍体峰，是否能和 坏死区别？因为偶用的作用细胞的蛋白本身可以造成细胞膜的损伤，所以 PI 可 以进入细胞，这是否意味着我检测的结果无法区分凋亡和坏死？ hdhdhd0000：用PI 法识别凋亡时，有一种方法叫 SUB-G1 法，这种方法需要在染 PI 前加入适量的破膜剂（磷酸盐－枸橼酸盐缓冲盐），我们称之为 PC 液，它会 让晚期凋亡所形成的 DNA 小碎片部分出膜而使胞内的 DNA 总含量减少，从而使流 式上的 DNA 直方图的 G0/G1 峰前出现一个亚二倍体峰，也就是 SUB－G1 峰（凋亡 峰）！ 用荧光 2 的面积做直方图可以清楚的看见凋亡峰，但是要区分 APo 和 Nec 需要少 量的经验，而在荧光 2 高度图上，因为是用的是对数，所以可以把凋亡和坏死拉 开，凋亡峰在不同的细胞周期特异性细胞凋亡时，都特异性的出现在 10 的 2 次 方荧光道数处，坏死在 10 的 1 次方处，从而可以清楚的分清它们。 核染色剂（核染料） yuanaiyu：用流式细胞仪测脑组织细胞悬液中细胞线粒体的膜电位，需先将细胞 与细胞碎片区分开来，现考虑用一种亲细胞核的染料将细胞分选出来，已尝试用 过 PI，但 pI 分子量大，过分破坏细胞膜而影响了线粒体膜电位。请问有没有一 种小分子的核染料，既能进入细胞核又对对细胞膜的影响很小？何处能买到？ shaman3: 常用的 DNA 特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI4 （6-diamidino 2-phenyl-indole dihydrochloride）。 三种染料与 DNA 的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA 的A-T 碱基区。紫外光激 发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst 是与 DNA 特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成 1mg/ml 的浓度， 使用时用 PBS 稀释成终浓度为 2~5mg/ml。 DAPI 为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成 1mg/ml 的浓 度，使用终浓度一般为 0.5 ~1mg/ml。 至于什么地方能买到，DAPI 常用在免疫荧光中，各大试剂公司都可订到，本人 比较偏于DAPI，就是因为用过后发现它将细胞核染得很漂亮，如图（自己做的）： flyingrisker: 流式本身就有区别细胞和细胞碎片的功能的呀。只要你在选要分 析的细胞群落的时候，只选相对比较密集的细胞区域，就可以把碎片的感染去掉 了。 你如果一定要用核染料，我觉得 Hoechst33258 不能用，因为它是紫外激发的， 可能会对你的细胞线粒体膜电位有影响。 至于核染色的漂亮与否，