荧光酶免疫测定.PPT

荧光免疫分析的基本原理 将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪 检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量 或超微量物质进行定量测定。 荧光抗体技术 荧光免疫测定 均相荧光免疫测定 （homogeneous fluorescence immunoassay） 非均相荧光免疫测定 （heterogeneous fluorescence immunoassay） 荧光免疫技术 荧光免疫技术的类型 荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏 感性相结合，对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测。 荧光免疫测定的方法类型 非均相荧光免疫测定：时间分辨荧光免疫测定、荧光酶免疫测定 均相荧光免疫测定：荧光偏振免疫测定 自发荧光寿命短:1ns～10ns 镧系元素寿命长:10μs～1000μs 短寿命荧光完全衰变后再测定镧系 元素特异荧光 基本原理 时间分辨荧光免疫测定 时间分辨检测原理示意图 时间分辨 stokes位移:激发光谱和发射光谱的波长差 镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光谱 和发射光谱不重叠 时间分辨荧光免疫测定 stokes位移 基本原理 发射光谱带较窄：613nm±10nm，干扰少 激发光谱带较宽：300nm～350nm，灵敏度高 时间分辨荧光免疫测定 基本原理 发射光谱和激发光谱 比活性：单位时间每个标记分子被探测的信号量 荧光激发光源1000次/S激发，比活性提高 时间分辨荧光免疫测定 基本原理 荧光标记物的相对比活性 时间分辨荧光免疫测定 结合β-二酮体 Eu3+解离 酸性增强液 荧光增强 Eu3+标记抗原抗体复合物 基本原理 信号增强 镧系元素 铕(Eu3+)（最常用） 钐(Sm3+) 铽(Tb3+) 钕(Nd3+) 镝(Dy3+) 标记物 时间分辨荧光免疫测定 1000 Dy3+-PTA 14 丹黄酰氯 714000 Eu3+-β-NTA 3.0 球蛋白 3.0 罗丹明B 96000 Tb3+-PTA 4.5 FITC 925000 Eu3+-PTA 3.5 细胞色素C 60000 Sm3+-PTA 4.1 人血清蛋白 65000 Sm3+ -β-NTA 1～10 非特异荧光背景 荧光寿命(ns) 荧光物质 荧光寿命(ns) 荧光物质 常见荧光物质的荧光寿命 标记方法 时间分辨荧光免疫测定 双功能螯合剂： 1-（对-苯偶氮）-EDTA 异硫氰酸苯基-EDTA 异硫氰酸苯甲基-DTTA 二乙烯三胺五乙酸（DTPA） 标记方法： 一步法：先螯合Eu3+，再连接蛋白质 二步法：先连接蛋白质，再螯合Eu3+ 方法类型 时间分辨荧光免疫测定 双抗体夹心法 固相抗体竞争法 固相抗原竞争法 方法类型 时间分辨荧光免疫测定 时间分辨荧光免疫测定（双抗体夹心法）示意图 双抗体夹心法 固相抗体和Eu3+标记抗体与待检 抗原结合，形成固相抗体-待检 抗原-Eu3+标记抗体复合物，酸性 增强液下，Eu3+解离，340nm激发 光下发射613nm荧光。 方法类型 时间分辨荧光免疫测定 固相抗体竞争法 待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体竞争结合, 温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧 光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。 方法类型 时间分辨荧光免疫测定 固相抗原竞争法 待检抗原和固相抗原竞争结合定量的Eu3+标记抗体， 温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强 度，荧光强度与待检抗原含量成反比。 灵敏度高：最小检出量10-18mol/L 分析范围宽：4～5个数量级 标记物稳定：有效使用期长 测量快速，易自动化 易受污染，本底增高 方法评价 时间分辨荧光免疫测定 荧光偏振免疫测定 光线通过偏振滤光片后， 形成一个方向的平面光称 为偏振光。 偏振荧光(绿光,525nm～550nm) 偏振光(蓝光,485nm) 荧光物质 基本原理 * *  第八章 荧光免疫技术 第一节 概述 荧光的基本知识 荧光（fluorescence） 荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧光。 荧光的基本知识 发射光谱和激发光谱 发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下记录的样品发射荧光的强度。 激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品记录的相应的荧光发射强度。 荧光的基本知识 荧光效率 定义:荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率 计算公式: 荧光效率= 荧光的基本知识 荧光寿命