质粒DNA转化大肠杆菌1试验目的.PPT

* * 质粒DNA转化大肠杆菌 1. 实验目的 掌握重组质粒DNA利用CaCl2法转化大肠杆菌的原理和方法。 2. 实验原理 2.1 CaCl2法转化大肠杆菌的原理 DNA重组分子在体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。 1970年Mandel和Higa发现用CaCl2处理过的大肠杆菌能够吸收噬菌体DNA，此后不久，Cohen等人用CaCl2法实现了质粒DNA转化大肠杆菌的感受态细胞，其整个操作程序为： 1）将处于对数生长期的细菌置入0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态； 2）此时加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成抗DNase的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上； 3）经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。 目前，Ca2+诱导法已成功地用于大肠杆菌、葡萄球菌以及其它一些革兰氏阴性菌的转化。 2.2转化率的影响因素 转化率的高低对于一般重组克隆实验关系