Adiponectin基因剔除LacZ基因敲入小鼠模型的建立.pdfVIP

生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biophys町， 2006 , 33(9): 846-853 -- MUFtm uu nr •••• , Adiponectin 基因剔除LacZ 基因 敲入小鼠模型的建立* 任维华 1 ， 2).. 李西华 1 ， 2) 王芳1)乔建E瓦川党素英ω -1L 辉 2) 王龙2， 4) 陆顺元4) 孙霞2) 徐国江2) 傅继梁2) 费俭2) 王铸钢以4) ••• (1)上海交通大学医学院医学遗传学教研室，上海 200025; 勾上海南方模式生物研究中心，上海 201203; 到上海交通大学医学院附属瑞金医院内分泌科，上海 200025; 。上海交通大学医学院附属瑞金医院医学基因组学国家重点实验室，上海 200025) 摘要 adiponectin 是脂肪细胞特异分泌的一种活性蛋白质，具有增加膜岛素敏感性、抗炎及抗动脉硬化等活性.建立 adiponectin 基因剔除β 半乳糖昔酶基因(LacZ) 敲入小鼠模型，可为整体动物水平研究adiponectin 基因功能及其表达调控机 制等提供理想工具.根据生物信息学方法获得adiponectin 基因组序列，设计基因剔除及敲入策略，在adiponectin 基因第2 和 第 3 号外显子剔除的同时，在其ATG 和信号肤序列后顺接LacZ 基因完整编码序列，构建完成了 Adipo-LacZ-XpPNT 基因剔 除质粒.通过电穿孔将打靶质粒转入ES 细胞，以 G418 和 ganciclovir 进行药物筛选，获得药物抗性的ES 细胞克隆， PCR 和 DNA 印迹鉴定出正确同掘重组克隆.将同源重组的 ES 细胞克隆注入小鼠囊胚得到嵌合体小鼠，嵌合体小鼠与 C57Bν6J 小 鼠交配产生杂合子小鼠，杂合子间交配获得 adiponectin 基因剔除LacZ 基因敲入纯合子小鼠.经 RT-PCR、 RNA 印迹和 ELISA 检测证实纯合子小鼠脂肪和血清中 adiponectin 基因表达呈阴性 RT♂CR、 RNA 印迹及蛋白质印迹检测发现， LacZ 基 因在突变小鼠脂肪组织中有特异性表达，其表达谱与内源性adipone唱tin 基因的表达谱一致.但在脂肪组织及外周血中未能检 测到LacZ 活性，且血清中LacZ 蛋白亦呈阴性.由此成功建立了 adiponectin 基因完全灭活及LacZ 基因以内源性 adiponectin 基因表达谱表达的小鼠模型，为进一步研究该基因功能及其表达调控创造了有利条件. 关键词 adiponec血，基因剔除， β 半乳糖苦酶基因(LacZ)，基因敲入 学科分类号 Q78 adiponectin是由脂肪细胞分泌的特异性蛋白. 步推测 adiponectin 在脂类代谢和膜岛素敏感性调节 人和鼠 adiponectin 分别由 244 和 247 个氨基酸组 中发挥主要作用.日本学者证明， adiponectin 可以 成，分子质量约为 30 ku. 其结构包括信号序列 特异性结合骨髓肌或肝脏细胞膜上的G 蛋白偶联受 (1 7aa)、非同源结构域(28础)、-个由 22 个 体 1 和受体 2，进而调节脂肪酸氧化和糖代谢叫 Gly-X-Y 重复的N 端胶原样结构域和一个与 TNFo. 到目前为止，对adiponectin 的表达调控机制尚未 之 p 片层结构相似的 C 端球状结构域 完全阐明如对肥胖者adiponectin 浓度反而下降这 (段时iponectin)组成[1 ，