应用不同DNA标记方法於环境微生物检测之研究.docVIP

應用不同DNA標記方法於環境微生物檢測之研究 王家振1、周裕然2 摘要 寡核苷酸修飾生物素(biotinylated oligo)常與寡核苷酸探針整合應用，其應用範疇包括EMSA(electrophoresis mobility shift assay, EMSA)、北方墨點法(northern blotting)與原位雜交法(in-situ hybridization)等，藉由生物素(biotin)與鏈黴卵白素(streptavidin)的酵素反應，而使標定的DNA(deoxyribonucleic acid, DNA)呈色。本研究比較三種DNA標，包括：biotin-labeled dUTPs 、biotin-labeled forward primer 及digoxigenin-labeled dUTPs，以缺氧-好氧(anoxic-oxic, AO)生物除氮程序(水力停留時間=10小時、污泥齡=30天、內部回流比=2.5)純化後之活性污泥純菌Acidovorax sp.純菌環境微生物菌種檢測技術另一可行方案。 標一、前言 1.1發展 16S rRNA(ribosomal ribonucleic acid, rRNA)基因序列進行分析、比較，使環境微生物進入一個新的世代[1-3]。 環境微生物菌相複雜，並具有高度生物多樣性(microbial biodiversity)，無法由人眼直接觀察到其生理特性，很難正確地判別出微生物間的差異，如何以分子生物診斷技術快速解析環境微生物亦是環境生物技術領域之重要研究課題。 核酸微陣列晶片(Nucleic acid microarrays)應用一個微小固體晶片表面上透過微加工技術，將寡核苷酸探針(oligonucleotide acid probes)以陣列方式固定，進而構建一套微分析系統，高通量的特色，可同時檢測來自環境樣本中不同的16S rRNA基因[-6]，快速檢測分 1 輔英科技大學生物技術系暨研究所 碩士 2 析環境微生物族群，提高辨識菌種的準確性。1.2 分子生物檢測技術現況 自微陣列技術誕生以來，許多標記檢測方法應運而生，如同位素、酶類、半抗原、螢光素等[7]，目前仍以螢光標記具有較多種類及靈敏度高等優點，亦是最常使用的標記檢測之方法，但此法必須依賴於昂貴的檢測儀器，檢測耗材成本高，較不適合一般實驗室進行常態性檢測，且檢測結果不能長期保存。而其它檢測方法如：基因選殖法(cloning)、Southern blot)、Northern blot)、螢光原位雜交法(Fluorescence in situ hybridization, FISH)、變性梯度凝膠電泳(Denature Gradient Gel Electrophoresis, DGGE) 、端點限制性片段長度多型性(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism, T-RFLP) 以及逢機擴增多形性DNA (random amplified polymorphic DNA, RAPD)1.3 研究目的 DNA(deoxyribonucleic acid, DNA)標記方法及缺氧好氧程序純化後之活性污泥DNA作為晶片檢測標的物，並發展出條狀(strip)晶片，且利用國外文獻發表具專一性探針(probe)，以明膠電泳法(Gel Electrophoresis)進行驗證。本研究之主要研究目的如下：(1) 應用不同DNA標記方法製備條狀晶片，以缺氧好氧程序1. 金奈米粒子種類 奈米粒子目前在各界均受到相當大的矚目。一般而言，粒徑介於1～100 nm 的粒子即稱為奈米粒子，涵蓋的範圍包括金屬、非金屬、高分子材料、磁性材料等。此粒徑範圍的粒子擁有一般巨觀材料所無法比擬的特殊性質，而且其大小與分子大小相近。奈米粒子已於許多領域均有很廣泛的研究。奈米材料的發展方向，包含有製備、純化分離、特性鑑定、應用等幾個方面。金奈米粒子其穩定性相當好，因此很多科學家致力於研究其性質；金奈米粒子於波長520 nm 處有表面電漿共振(Surface Plasma Resonance, SPR)吸收，對於普通的視覺觀察有相當大的幫助。 我們一般看到金的金屬是屬於巨觀的物質，金的性質為黃色帶有金屬色澤，惰性金屬其活性很低；而奈米金的性質和一般的金有很大的不同，奈米金其光學性質會因體積的極度縮小而有所改變，隨著粒徑的逐漸縮小，顏色的變化依序為黃、橘約100奈米、綠約50奈米、暗紅約13奈米 圖1 各種奈米粒子尺寸的顏色變化 目前所知，奈米粒子在很多方面都有應用價值。像光學方面，由於其粒徑小，對可見光、紫外光或紅外光的散射和反射量相當少，可作為隱形材料。另一方面的光譜性質已與生物化學領域中之