兔肠艾美耳球虫实时荧光定量PCR检测方法的建立.pdfVIP

动物医学进展，2015 ， 36(5):36-39 Progress in Veterinary Medicine 兔肠艾美耳球虫实时荧光定量PCR 检测方法的建立 许家园，程 田，胡会朋，陈晓珍，翁亚彪，林瑞庆 (华南农业大学兽医学院，广东广州 510642) 摘 要:为建立一种肠艾美耳球虫定量的检测方法，在肠艾美耳冻虫核糖体第二内转录间隔区(lTS2) 序列设计一对特异性引物，以 10 倍倍比稀释的已知卵囊含量的肠艾美耳球虫 DNA 为模板进行 SYBR Green 1real-time PCR 的扩增和标准曲线的建立。结果显示，最低可检测 1 个卵囊含量的样品，与同属的 黄文美耳球虫、中型艾美耳球虫、大型文美耳球虫均不发生交叉反应，重复性变异系数小于 2% 。表明建立 的实时荧光定量 PCR 检测方法灵敏度高，特异性强，重复性好，可为快速检测肠艾美耳球虫提供有效的方 法。 关键词:兔;肠艾美耳球虫;SYBR Green 1 ;实时荧光定量 PCR 文章编号:1007-5038(201日05-0036-04 中固分类号:S852.723 文献标识码:A 兔球虫病是由艾美耳属球虫寄生于家兔肝胆管 中型艾美耳球虫和大型艾美耳球虫纯种卵囊均由佛 及肠上皮细胞内引起的一种最常见的原虫性疾病， 山正典生物技术有限公司提供。 1. 1. 2 主要试剂 DNA 提取试剂盒 Wizard SV 该病流行广泛[叫，对不同年龄段的兔均有不同程度 Genomic DNA Purification System 购置于 Promega 的危害，严重影响养兔业的健康发展[3] 。国际上公 公司。蛋白酶K 购置于 Merck 公司。 SYBR Green 认的兔艾美耳球虫有 11 个种问，其中肠艾美耳球虫 Premix Ex T aq 11 、 Ex-Taq DNA 聚合酶、分子质量 是 3 种强致病性兔球虫虫种之一，能引起严重的球 标准 DL-500 DNA Size Marker 为宝生物工程(大 虫病。因此，开展对该病病原的检测对其防控有重 连)有限公司产品。 要的意义。 1. 2 方法 长期以来，对球虫病的诊断主要依靠传统的卵 1. 2. 1 引物设计 根据 GenBank 中肠艾美耳球虫 囊形态、致病性、寄生部位、肠道病变特征等指标[町， ITS2 序列，用 Primer 5.0 设计一对特异性引物，上 近年来普通 PCR 也逐渐用于兔球虫的检测[叫，促 游引物 F:S-TTGTTCAATGCTGTTGCCGA -3 , 进了兔球虫的分子鉴定研究。实时荧光定量 PCR 下游引物 R: 5-CCTCATCTTTCCACCACCGT - (real-time PCR) 具有重复性好、灵敏度高、定量准 3 ，预计扩增片段 160 忡，引物由华大基因公司合 确、工作效率高等优点[町，近年来国外不少学者将此 方法用于检测临床寄生虫的感染，Morgan J A T 成。 1. 2.2 肠艾美耳球虫卵囊 DNA 提取 用血球计