混合氨基酸未知组分.pptVIP

实验二 氨基酸的薄层层析 一、实验目的 1．了解薄层层析的一般原理以及层析技术优点 2．掌握硅胶薄层层析的基本技术 二、实验原理 薄层层析是层析法的一种。 层析法是利用被分离样品混合物中各组分的物理、化学差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，这两个相通常使一个被固定在一定的支持物上的，称为固定相；另一个是移动的，称为流动相；当流动相流过固定相时，在移动过程中由于各组分在两相中的分配情况不同（或吸附性质不同、或电荷分布不同、或离子亲和力不同等），而以不同速度前进，从而达到分离的目的。 薄层层析是将一种固定支持物均匀地涂在薄板上，对物质进行层析的方法。本实验采用吸附薄层层析，即所用固定支持物是吸附剂（硅胶G粉），主要是根据吸附剂对样品中各组分的吸附能力不同，使得各组分的移动速度不同，从而达到分离混合物的目的。 二、实验原理 氨基酸在硅胶G薄板上展层时, 与硅胶分子有一定的吸附力。由于不同氨基酸的理化性质(分子极性、分子大小和形状、分子亲和力等)不同，使其与硅胶分子间的吸附力不同，造成各种氨基酸在展层过程中在薄板上移动的距离不同，从而将不同的氨基酸离出来。 氨基酸在薄板上移动的速率可用Rf值表示。Rf是原点至各斑点中心的距离r与原点至展开剂前沿的距离R的比值。将标准氨基酸和混合氨基酸在同一薄板上一起展开，通过在同一薄板上的已知标准氨基酸的Rf值和未知组分的混合氨基酸的Rf值进行对照，就可初步鉴定未知混合氨基酸的成分。 三、实验试剂与器材 1.实验试剂 (1) 混合氨基酸: 未知组分 (2) 标准氨基酸：甘氨酸、亮氨酸 (3) 展开剂——正丁醇：冰乙酸：蒸馏水=4:1:1 (4) 显色剂—— 0.1％茚三酮无水乙醇溶液 (5) 吸附剂——硅胶G (6) 粘合剂——0.5%羧甲基纤维素钠 三、实验试剂与器材 2.实验器材 (1) 托盘天平、研钵、玻璃板（5.5cm×10cm）、 玻璃棒、量筒（10ml）、烘箱 (2) 铅笔、直尺、橡胶手套、点样毛细管 (3) 立式层析缸、热吹风机 (4) 玻璃喷雾器 四、实验步骤 四、实验步骤 1．铺板 称取2g硅胶G ，在研钵中加入5ml 0.5%羧甲基纤维素钠，研磨成糊。 取洗净烘干的玻璃板一块，水平放置。在玻璃板的一端倒上调好的硅胶Ｇ糊，用玻璃棒将硅胶G糊刮向另一端，轻轻在玻璃板下端敲打，使硅胶Ｇ糊均匀分布，即成1mm厚的薄板。水平放置，室温干燥待用。 2．活化 将薄板置105℃烤箱烘烤60min使活化，置干燥器备用。 四、实验步骤 3．点样 先在薄板上距离边缘1.5cm处划一条直线，确定点样位置。用毛细管点样，每个斑点点两次。点样时，毛细管与薄膜垂直方向轻轻碰点样处，每点在纸上扩散的直径不超过2mm。点样过程中，必须在第一点样品干后再点第二滴。操作者需戴上橡胶手套。 4．展开 将适量展开剂倒入层析缸，加盖密闭，保持10分钟，使缸内展开剂蒸气达到饱和。将薄板放进层析缸（点样端朝下），注意点样线要高于展析溶剂液面，不能浸入。加盖密闭，进行层析。当展开剂前沿达到薄板3/4 高度时（约50min），将薄板自层析缸内取出，用铅笔在前沿处作一记号，然后用电吹风吹干。 四、实验步骤 5．显色 用玻璃喷雾器向薄层板均匀喷洒0.1%茚三酮无水乙醇溶液。待乙醇挥干后，将薄板置105℃烤箱中烘烤或者用热吹风机吹干，至呈现紫红色氨基酸斑点为止。用铅笔圈出氨基酸斑点，量出点样线至展开剂前沿的距离R及点样线至各斑点中心的距离r，计算迁移率Rf。 五、结果处理 原点至斑点中心的距离（r） Rf＝───────────── 原点至展开剂前沿的距离（R） 标准氨基酸的Rf 值 VS 混合氨基酸的Rf 值 确定混合氨基酸中含有哪些种氨基酸。 六、思考题 1. 影响Rf值的因素？ 2. 本实验在操作过程中有哪些方面是实验成功的关键？ 参考答案 2.影响Rf值的因素： ①展层溶剂的样品组分的性质: 样品组分若在固定相中溶解度较大,在流动相中溶解度小,则Rf值小;反之,Rf值大. ②吸附剂的性质和质量. ③吸附剂的活度. ④薄层的厚度. ⑤层析槽的形状、大小和饱各度. ⑥展层方式. ⑦杂质的存在和量的多少. ⑧展层的距离. ⑨样品量. ⑩温度. 由于影响Rf值因的因素很多,故不能仅根据Rf值来鉴定未知样品组分.一般采用几种薄层层析法来确证样品的未知组分,如一种用吸附薄层层析,另一种用聚酰胺薄层层析等.实践中,也可把未知样品与标准品混合点样,然后进行薄层层析.如果在几个不同类型的薄层层析中,两者都不发生分离,则可证明这两个化合物是相同的.  * * 2.活化 3.点样 4.