第二章 层析技术.ppt

* * 九.亲和柱层析（Affinity Chromatography） 亲和层析是利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种层析技术。 * 应用 分离纯化酶、 抗原、抗体 分离纯化核酸 研究酶的结构与功能 + 待纯化分子 配体 a. 待纯化分子和配体间具有亲和性 + 基质 b. 活性基质与配体结合产生亲和吸附剂 + + 杂质 c. 待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离 + d. 偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子 原理： 基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、 sepharose、sephadex * * 酶：底物、底物类似物、抑制剂、辅酶、金属离子； 抗体：抗原、病毒、细胞； 激素、维生素：受体蛋白、载体蛋白； 外源凝集素(Lectin)：多糖、糖蛋白、细胞表面受体蛋白、细胞； 核酸: 互补碱基链段、组蛋白、核酸聚合酶、核酸结合蛋白； 细胞: 细胞表面特异蛋白、外源凝集素。 亲和色谱中采用的生物亲和关系： * * * * * * * 十.气相色谱(gas chromatography) 气相色谱是20世纪50-60年代发展起来的一种高效，快速分析方法； 分为填充柱气相色谱和毛细管气相色谱两类。前者的固定相又可分为固体(吸附剂)和液体两类；后者固定相是液体； 凡用气相色谱测定的样品均需气化； * * Analysis of 13 component sugar mixture * 十一.高效液相色谱 （High Performance Liquid Chromatography，HPLC） 优点：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度高，应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物； 缺点：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多。目前的发展趋势是向生物化学和药物分析及制备型倾斜； * 高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 记录系统 * * * 最常用的“万能柱”填料为“C18”，简称“ODS”柱，即十八烷基硅烷键合硅胶填料（Octadecylsilyl，ODS）； C18是长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，对各种类型的生物大分子有更强的适应能力，在生物化学分析工作中应用的最为广泛； 11.1 固定相 * 采用 Agilent 1100 series 反向高效液相色谱，以20μl样品进样，色谱检测条件为varian C18反向分析柱（250mm×4.6mm×5μm），检测波长274nm，流动相（ 水：甲醇：乙腈＝60%:16%:24%）流速1ml/min，柱压约260，柱温为室温（15℃）。 * 11.2 流动相 反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下： H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜异丙醇＜四氢呋喃 最常用的流动相是：“甲醇—H2O”和“乙腈—H2O”； 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是： 正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜异丙醇 最常用的是正已烷，虽然其价格较贵，但80％的顺、反和邻位、对位异构体仍然要用正相色谱来进行分离。 * 在实验条件下，色谱柱后仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线； 在稳定的条件下应是一条水平的直线； 11.3 基本参数 11.3.1 基线 11.3.2 峰高和峰面积 色谱峰顶点与基线的距离叫峰高； 色谱峰与峰底基线所围成区域的面积叫峰面积； * 保留时间“ tR”：进样至出峰的时间； 死时间“ t0”：不被柱子吸附的惰性物质的出峰时间； 例如：正相色谱常用四氯化碳， 反相色谱常用甲醇、尿嘧啶、NaNO3等； 11.3.3 保留值 * K’值 保留体积：VR＝tR?FC ( FC ---流动相的流速 mL/min ) VR 是在 tR 时间内流动相流过柱子的体积。 调整保留时间：tR’＝ tR－t0 调整保留体积：VR’＝ VR－V0＝tR’ ?FC * 选择性指标“α’ ”和相对保留值“α” α’ 可以更直观和方便地反映色谱峰分离的好坏： 相对保留值α(分离因子)： ( α＞1.1为好 ) * 理论塔板数 ： ?—标准偏差，曲线拐点处峰宽的2? 一半，即峰高0.607处峰宽的一半； ?