一种用于酿造葡萄醋的酵母菌及其制备方法.docVIP

一种用于酿造葡萄醋的酵母菌及其制备方法 技术领域 本发明涉及微生物技术领域，具体地说是一种用于酿造葡萄醋的酵母菌及其制备方法。 背景技术 葡萄是葡萄科植物的果实，为落叶藤本植物，是世界最古老的种植植物之一。葡萄原产于欧洲、西亚和北非一带，现我国南北各地均有生产，主要产于新疆、甘肃、山西、河北、山东、江浙和云南等地。葡萄中的多量果酸有助于消化，能健脾和胃，把葡萄酿制成葡萄醋能够减少肠道内不良细菌的数量、帮助有益菌繁殖，消除皮肤色斑。此外，葡萄醋是生理碱性食品，葡萄醋内的多糖、钾离子能降低体内的酸性，从而缓解疲劳，增强体力。 目前国内外报道了不少制造葡萄醋的方法，国内已经有不少关于葡萄醋制备的报道： 如申请号200610048850.4《葡萄醋的制备方法》其方法系自然发酵，产品一致性难以保证，醋酸含量低，只能季节性生产等。 如申请号20071005808.5《葡萄醋的制备方法》其方法是用葡萄汁加蜂蜜、白砂糖、山梨酸等调制，不是酿造。 如申请9《一种葡萄醋的制备方法》其方法是鲜葡萄汁、醋精，白糖等搅拌混合制，并非发酵和酿造。 如申请8《一种山葡萄醋汁及其制造方法》，该醋是纯粮酿造出来的醋和山葡萄为原料制造葡萄醋。 如申请号200910073703.6《葡萄与粮食混合发酵生产葡萄醋方法》，其方法生产的不是纯的葡萄醋。 这些专利文献公开的方法都具有一个共同点，就是其原料都以葡萄果实或葡萄汁为原料，混合食醋、山梨酸，或者粮食发酵后形成的制造葡萄醋。目前还未见报道直接用葡萄酒为原料，加以毕赤酵母醋酸菌发酵，来生产优质葡萄醋。 发明内容 本发明的目的是提供一种用于酿造葡萄醋的酵母菌及其制备方法。 本发明的酵母菌是毕赤酵母菌，其保藏登记号为：CGMCC No.3076,分类命名为：巴氏毕赤酵母（Pichia pastoris）,该菌株于2009年5月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。 本发明的酵母菌的制备方法如下： 1）菌种的获得： 葡萄酒暴露在空气中时间一长就会变酸，这就是葡萄酒和自然界中的醋酸菌发生反应，或者在葡萄酒酿造过程中，当葡萄鲜果中糖份全部发酵成酒精后，没有及时终止发酵，慢慢葡萄酒也就发酸变成是醋非醋的酸酒，这也是空气中的醋酸菌和葡萄酒发生的醋酸反应，利用这一现象获取的毕赤酵母醋酸菌，获取和分离培养程序如下： 将鲜果发酵得到的新鲜葡萄酒（不终止发酵即不加二氧化硫），放入大广口有色玻璃绕环内，深度是广口的1/5，上面用纱布盖好，放在通风避光处，待酒向上集结出一层白色薄膜，这个薄膜就是通常叫醋膜，从其中优选出纯度高、产酸多的醋酸菌菌种； 2）将上述菌种移到无菌水中稀释至10ˉ4～10ˉ5 倍，制备平板分离培养基组成：葡萄糖10%，蛋白胨 2% ，酵母膏1% ，琼脂1.5%加入要酿造的葡萄酒至100%；培养基在无菌条件下先加入4%酒精，将稀释至10ˉ4～10ˉ5倍浓度的醋酸菌1mL分成0.1mL个点滴在培养基上，送至30℃恒温箱培养，培养5天后出现醋酸菌菌落，选取单菌落直径最大的，取出再稀释至10ˉ4～10ˉ5倍，再重复培养三次； 3）将上述2）步骤生长较快的菌种取出用无菌水稀释至10ˉ4～10ˉ5倍，进行印迹法培养，印迹法培养基组成：葡萄糖10%，蛋白胨2%，酵母膏1%，Caco3 2%，琼脂1.5% ，加入要酿造的葡萄酒至100%；将稀释至10ˉ4～10ˉ5倍浓度的菌种按每滴0.1mL点滴在备制好的印迹法培养基上（每个培养基上最多能滴5个点，每点间留有足够的距离），将培养基放入30℃恒温箱培养3～5天后，产酸能力强，并生长健壮的醋酸菌，将这个菌种选出进行第二次的印迹法培养，至3～4次的印迹法培养后，产出稳定的醋酸菌种，即巴氏毕赤酵母（Pichia pastoris）。 将这个菌种繁殖保存或经Ⅰ级Ⅱ级菌种培养扩繁后用于生产。 种菌的形态特征：用普通光学显微镜观察菌种，细胞形态为卵形，该菌无性繁殖方式是细胞芽殖、有假菌丝，有性繁殖方式是产生子囊，子囊呈半园形，表面光滑。菌落为乳白色，圆形，干燥无光泽，在培养基上容易被挑起。 分子鉴定：提取酵母菌核DNA，用酵母菌通用引物进行18SrDNA的PCR扩增，PCR产物连接到pMD18-T载体后进行测序，将测序结果在NCB1上进行BLAST分析，结果表明与pichia sp.NRRL Y-27259菌具有99%有同源性。 特性： 最适生酸温度 28℃～33℃； 酒精平均转化率 93%～95%； 最高耐酸量 9～11（以醋酸计）。 利用本发明的毕赤酵母醋酸菌可将葡萄酒发酵成葡萄醋来生产一种葡萄醋，能克服现有葡萄醋生产过程中原料受季节影响限制的缺点，并可以缩短发酵周期，减