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ELISPOT实验操作指南 一、物品准备： 动物房：小鼠处死所需材料：75%乙醇，酒精棉，PE手套，记号笔，袋子； 取血准备材料： 镊子，标好组别的EP管 细胞室： 6孔板3块（按每孔放一组脾）；平皿6套(每2组一套)； 剪刀、镊子若干；5ml注射器15个； 200目纱网（剪成许多块，一般每组3块，一大一小）；折成四折灭菌。 蓝、黄枪头若干盒； 液体塑料槽5个以上，排枪2把； 离心筒(15ml,50ml)按每组2-3个准备，各30个； 吸管（10ml ，5ml） 4-5筒，1.5ep管1饭盒，冻存管1饭盒。 离心机 T-75 培养瓶 CO2 培养箱 显微镜 血球记数板 水浴锅 96孔板： 1、ELISPOT板：96孔板-Millipore MultiScreen-HA plate (0.45um Surfactant-Free Mixed Cellulose, Ester embrane#MAHAS4510)，每板可测八组样品，共需2块。 注：头一天晚上照两个台子（一个做CTL一个处理靶细胞） 二、所需溶液： 1．需配制并灭菌液体： RPMI 1640 RPMI-3 R5 无酚红RPMI 1640(HyQ, cat no: SH30197.03) DMEM 小牛血清 双抗（青霉素/链霉素） 谷氨酰胺 无菌水（500ml）、PBS、PBST 、ACK（上述液体均需足够量并无菌）； 2．需确认及领用溶液及试剂： IFN-r抗体（BD公司, purified anti-mouse ifn-r(capture) cat no: 551216, 或51-2525kc）； 一抗 (biotinylated mAb for IFN-gamma, BD公司，cat no: 551506)； 二抗（BD公司, streptavidin-HRP concentrate A，cat no: 51-9000209(557630)）； ficoll-paque（Amershan公司）8.29 g NH4Cl (0.15 M)；1 g KHCO3 (10.0 mM)；37.2 mgNa2EDTA (0.1 mM) 加800 ml 水，用1 N HCl 调pH 到 7.2-7.4；加水定容到1升。 0.2-目的过滤除菌储存于室温。 PBS配方：8g Nacl, 0.2gKcl, 1.44gNa2HPO4, 0.24gKH2PO4, 加H2O 至 1升 调PH7.2。 四、脾细胞分离 准备：ACK提前取出放室温。2个50ml离心筒，1个H2O（灭），1个70%酒精。 拉颈处死小鼠，无菌操作取脾，尽量将结缔组织去除。将脾放含有RPMI-培养基的每组脾放置在一个。将脾放置纱网中RPMI-3培养基，用纱网包裹脾用5ml注射器研磨。用一新纱网再过滤一遍至50ml 4 ml RPMI-3洗涤培养皿，如果必要重复操作。每个脾加入3 mlRPMI-3培养基200 g 离心10 min，去除上清。用RPMI-3培养基2-3ml（培养基与ACK 缓冲液比例为1：2）室温放置5 min，时而振动。 20C，200g 离心10 min。裂解好的细胞沉淀应呈乳黄色，如果红细胞裂解不彻底可重复裂解。20 ml 200g 离心5min。最后用7.5ml无酚红R-5培养基重悬（此步开始用无酚红培养基R5）。若不做脾细胞分离试验，则此时用2ml培养基重悬。 用滤网再过滤一遍。 午休吃饭。 脾细胞计数： i 一般情况5只鼠脾细胞应稀释至少100倍再计数，990ul PBS+10ul 细胞。 ii 取20 ul 的细胞加入到20 ul的Trypan Blue里。 iii 在血球计数器上加入20 ul混合液。 iiii 计4个方格中白色细胞总数(查上不查下，查左不查有)，细胞密度（cells/ml） =4个方格中白色细胞总数/4*2* 104 用RPMI-5(无酚红)培养基稀释脾细胞至1×107 cells/ml 再计数一遍，检查是否达到稀释浓度。若差别大，重新稀释。 七、ELISPOT实验 ELISPOT 操作规程 第一天（杀鼠取脾前一天） 1．抗体包被板： 用IFN-gamma 抗体包被elispot 96-孔板。在5ml PBS 中加入1mg/ml的IFNr R4-6A2 (Pharmingen-18181D)25 ul,使浓度达5ug/ml，每孔加入50 ul。加盖 4℃过夜。（一块96孔板需5ml） 第二天 (杀鼠取脾) 操作过程如CTL中脾细胞分离相同 2．封闭 弃去包被抗体，用含10%胎牛血清的完全培养基(RPMI-10)洗涤一次，每孔加入200ul完全培养基，加