抗核抗体的检测.pptVIP

实验  抗核抗体的检测 抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）又称抗核酸抗原抗体，是一组将自身真核细胞的各种成分如脱氧核糖核蛋白（DNP）、DNA、可提取的核抗原（ENA）和RNA等作为靶抗原的自身抗体的总称，能与所有动物的细胞核发生反应，主要存在于血清中，也可存在于胸水、关节滑膜液和尿液中。 抗核抗体在多种自身免疫病中均呈不同程度的阳性率，如 系统性红斑狼疮（SLE，95%~100%）、 类风湿性关节炎（RA，10%~20%）、 混合性结缔组织病（MCTD，80%~100%）、 干燥综合症（SjS,10%~40%）、 全身性硬皮病（85%~90%）、 狼疮性肝炎（95%~100%）、 原发性胆汁性肝硬化（95%~100%）等， 但经皮质激素治疗后，阳性率可降低。 一 实验原理 二 试剂与器材 1.小白鼠（4-6周龄） 2.待测血清 阴性对照 阳性对照 3FITC标记羊抗人IgG 4.丙酮 缓冲甘油（9份甘油+1份PBS） 5.小鼠解剖工具 玻片 湿盒 荧光显微镜 三 操作步骤 1.抗原片的制备 处死小鼠 取肝脏 找到肝门静脉用生理盐水清洗干净 切下切面为0.5-1cm2的肝组织 印片 晾干 加丙酮固定10-15min 2.荧光染色 在做好的肝印片上加待测血清 阴阳性对照各50μl　 把加好的血清的肝印片放于37℃湿盒中温育30min PBS洗涤5次，再用蒸馏水洗3次 晾干后每孔加50μl 荧光标记抗体 37℃湿盒中温育30min PBS洗涤5次，再用蒸馏水洗3次 晾干后甘油封片 3.镜检 阴性：没有荧光 阳性：黑色背景下出现黄绿色荧光 非特异性的染色：模糊 较暗 块状 片状荧光 五 注意事项 1.抗原片不宜太厚，否则容易出现非特异性荧光 2.滴加血清或者荧光标记抗体一定要覆盖抗原片，否则容易出现假阴性 3.染好的片子要及时观察 六 临床意义 * * （酶组织化学技术和荧光染色技术） ANA细胞靶抗原成份模式图 真核细胞 高尔基体 分泌颗粒 粗面内质网 核仁 核粒子 糖原颗粒 溶酶体 细胞骨架蛋白 细胞膜 线粒体 滑面内质网 中心粒 利用一定波长的激发光对样品进行激发，产生一定波长的荧光，对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。 荧光显微镜的工作原理 荧光显微镜的结构 特点：核质均匀染色，分裂期浓 缩染色 ANA：均质型 特点：核质呈藕孔状 ANA：斑点型 相关疾病：SLE、药物狼疮等 相关疾病：SLE、MCTD、SS等