第二章.基因工程主要技术原理电泳、杂交.ppt

第二章 基因操作的主要技术原理 分子生物学主要技术 第一节 核酸的凝胶电泳 2.1.1 原理 2.1.2 琼脂糖凝胶电泳 不同浓度琼脂糖凝胶的分辨能力 电泳装置 凝胶电泳的优点 指示剂 溴化乙锭染色 电泳照片 银染 LMP琼脂糖回收DNA分子 变性胶电泳 2.1.3 脉冲电场凝胶电泳 “电泳”思考题 第二节 核酸分子杂交 2.2.1 Southern blot Southern blot原理模式 Southern blot转移装置图 Southern blot自显影图样 探 针 标 记 DIG标记/检测举例 2.2.2 Northern blot 2.2.3 Western blot 2.2.4 原位杂交：菌落杂交和空斑杂交 2.2.5 斑点杂交 回答问题 简要步骤 制备样品 SDS样品 蛋白质转移 硝酸纤维素滤膜，电转移：三夹板/隔离电极板；干燥 染色 丽春红S or 印度墨水（射启性检测适用） 但现少采用，由于有prestain MW marker 封闭背景 脱脂奶粉 5% 第一抗体与靶蛋白结合 二级免疫反应 抗免疫球蛋白抗体或A 蛋白? 标记：125I 碱性磷酸酶 辣根过氧化物酶 偶联 A蛋白可与IgG的Fc片段binding? 木瓜蛋白酶切割IgG Fragment antigen binding， Fragment crystalline 返回第二节 菌落生长 点种：阳性重组子→二个平板上（有/无膜）； 加CK 影印：菌落和空斑，绝大多数应为重组子（白色菌落）? DNA的释放与固定：有多种方法 10%SDS 0.5N NaOH/1.5N NaCl 0.5M Tris 1.5N NaCl SSC 干燥 固定 80℃ 2hr 返回第二节 * 基因工程 绪论 * 基因工程 * 基因工程 第二章 基因工程技术原理 第一节 核酸的凝胶电泳 第二节 核酸分子杂交 第三节 PCR基因扩增 第四节 基因定点诱变 第五节 DNA核苷酸序列分析 第六节 研究DNA与蛋白质相互作用的方法 返回目录 密度梯度超速离心和电子显微镜技术 DNA分子的切割与连接 核酸分子杂交、凝胶电泳、DNA序列结构分析以及基因的人工合成、基因定点突变和PCR扩增等多种新技术、新方法。 DNA分子的切割与连接，是基因操作的核心部分 返回第二章 返回目录 1.基本原理 2.琼脂糖凝胶电泳 3.脉冲电场凝胶电泳 返回第二章 返回目录 电泳及迁移率 核苷酸链多聚阴离子 在生理条件下，核酸分子的糖一磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。相同分子量的双链DNA 几乎具有等量净电荷 无反应活性的稳定的介质 降低了对流运动，故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。已知摩擦系数是分子的大小、极性及介质粘度的函数，分子大小的不同、构型或形状的差异，所带的净电荷的多寡，便彼此分离开来。 琼脂糖为线性多糖聚合物，红色海藻产物琼脂中提取而来。琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固，密度由浓度决定的。 分辨能力同凝胶的类型和浓度有关:琼脂糖凝胶分辨 范围为0．2～50kb之间. 50～1 20％琼脂糖 500～25 10％琼脂糖 1000～100 4.0％琼脂糖 6 000～300 1.4％琼脂糖 20 000～1000 0.7％琼脂糖 50 000～1000 0.3％琼脂糖 分离DNA片段的大小范围（bp） 凝胶类型及浓度 它不单是一种分析的手段，同时也可以用来制备和纯化特定的DNA片段。在这方面，低熔点（LMP）的琼脂糖凝胶较为方便。 LMP琼脂糖是一种熔点为62～65 ℃的琼脂衍生物，它一旦熔解，便可在37℃下持续保持液体状态达数小时之久，而在25℃下也可持续保持液体状态约10分钟。LMP琼脂糖可以不经电洗脱或破碎凝胶，即可用来回收DNA分子。 常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.溴酚兰在碱性液体中 呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、 0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同。二甲苯青的水溶液呈兰色，在 1%和1.4%琼脂糖中迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA相似. 指示剂一般与蔗糖、甘油组成载样缓冲液. 作用有①增加样 品密度.②在电泳中形成肉眼可见的指 示带，可预测核酸电泳的速度和位置.③使样品呈色，加样操作更方便 溴化乙锭（ethidium bromide，简称EtBr），是一种具扁平分子的核酸染料，在一切可能的部位同DNA分子结合，却不能同琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶结合并在300nm紫外光照射下放射