左旋肉碱在人角膜和结膜上皮细胞的转运机制分析研究.pdfVIP

中文摘要 左旋肉碱在人角膜和结膜上皮细胞的转运机制研究 摘 要 化、促进能量的产生、抗氧化与清除自由基等多种重要生理功能。机体可 少量合成左旋肉碱，大部分需要从饮食中获得。左旋肉碱的缺乏可导致疲 劳、肌无力、心肌病、低血糖症及意识混乱等。人眼泪中可以检测到游离 及乙酰化左旋肉碱存在。国外有研究表明，将左旋肉碱作为细胞的渗透压 保护剂添加于用于治疗干眼症的人工泪液中，可显著改善干眼症患者的临 床症状，但其作用机制未明，特别是泪液中的左旋肉碱是通过什么途径被 转运入细胞内尚未见报道d · cation transporter， 近年来大量研究表明，有机阳离子转运蛋白(Organic OCTN)可转运肉碱进入细胞内，故又称肉碱／有机阳离子转运蛋白。OCTN 包括肾、脑、骨骼肌、心肌、乳腺以及胎盘组织中均有表达。虽然有功能 性研究表明，兔眼结膜组织中存在载体介导的有机阳离子转运系统，但左 旋肉碱在人角膜和结膜上皮细胞的转运机制尚不清楚。 本研究拟从基因水平和蛋白水平上观察OCTNs在人眼角膜和结膜上 皮细胞的表达与分布，并从功能上研究左旋肉碱在这些细胞的转运特性和 动力学参数，以揭示左旋肉碱在人眼表上皮细胞的转运机制，为临床应用 左旋肉碱治疗干眼症提供结构和功能基础，为进一步开发含左旋肉碱的人 工泪液提供理论依据。 方法：1在基因水平上采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT．PCR) 的方法检测OCTNl和OCTN2 corneal mRNA在人角膜边缘上皮(Human limbal epithelia，HCLE)细胞和人结膜上皮(Humanconjunctivalepithelia, HCjE)细胞的表达，并通过测定目的产物的核苷酸序列来确认扩增反应的 特异性。 2在蛋白水平上采用WesternBlot、免疫细胞化学和免疫组织化学的 中文摘要 的表达及亚细胞分布情况。 3采用放射性摄入实验观察左旋肉碱转运的功能特性及动力学特征。 将HCLE或HCiE细胞与【3明标记的左旋肉碱在一定条件下孵育，然后洗 涤并裂解细胞，测定细胞内放射性的摄入量，观察左旋肉碱摄入实验的饱 和曲线、动力学参数等。 转运速率(V一)，公式如下： v=IV懈l×【s】／(K哪l+[s])+Vm∞aX[s]／(Km2+[s】) 其中vSn[s]分别是底物的吸收速度和底物浓度，l和2分别代表高、 低亲和力。以双倒数作图法(Lineweaver-Burk plots)确定Km和V一数 值。 4统计学分析所有实验结果以Mean+SD表示。应用SPSS13．0软 件进行Students非配对t检验，以P0．05为差异有统计学意义。 mRNA扩增产物。通过序列分析证实了PCR 检测到了OCTNl和OCTN2 扩增产物与目的基因的同一性。在HCLE细胞中，OCTNl的相对表达水 胞定位与OCTNl基本相同。 极性，采用超速离心法分别提取HCLE和HCjE细胞的顶端和基底端膜蛋 blot分析。结果显示，OCTNl和 白进行OCTNl和OCTN2的Western OCTN2两种转运蛋白均在细胞顶端出现明显强于基底端的条带，提示 OCTNl和OCTN2主要位于HCLE和HCjE细胞的顶端。 定位，结果显示：OCTNl和OCTN2两种转运蛋白在兔角膜和结膜上皮 强烈表达，并且主要位于上皮细胞的顶端面。另外，OCTNl在兔角膜和 结膜上皮细胞表达基本相同，但对OCTN2来讲，其免疫反应性却与 中文摘要 O