单增李斯特菌三重实时荧光PCR检测的建立及其毒力基因在分离菌株中分布.pdfVIP

中国人兽共患病学报 2016 , 32 (5) Chinese Journal of Zoonoses 451 001: 10. 3969/j. issn. 1002-2694.2016.05.007 单增李斯特菌三重实时荧光 PCR 检测的建立 及其毒力基因在分离菌株中分布 刘二龙1 ，袁慕云2 ，吕英姿l ，陈 颖3 ，王婷3 ，许龙岩2 ， 李嘉琪l ，郑高彬l ，杜雅萍1 ，林学勤l 摘 要:目的 建立同时检测单增李斯特菌(Listeria monocytogenes ,Lm) 溶血素基因 hlyA 、内化素基因 inlA 和磷脂酶 C 基因 plcB 的 TaqMan-MGB 三重实时荧光 PCR 检测方法，并对 101 株单增李斯特菌的 hlyA 、 inlA 和 ρlcB 基因进行了检测， 分析 3 个毒力基因在多位点序列分型(Multilocus sequence typing , MLST) 聚类群组中的分布情况。方法 根据单增李斯特 菌毒力基因 hlyA ， inlA 和 ρlcB 的保守序列设计引物和小沟结合物(minor groove binder ， MGB)探针建立三重荧光 PCR 方法， 对其特异性、灵敏度和可重复性进行了测试，并对分离的 101 株单增李斯特菌进行三重 PCR 检测。结果 建立的三重实时荧 光 PCR 方法特异于单增李斯特菌的检测，重复性良好，组内 Ct 值变异系数均小于1. 5% ，灵敏度可达 100 CFU/mL。对 101 株单增李斯特菌的 hlyA 、 inlA 和 ρlcB 的检出率分别为 98% 、 75% 和 98% 。在可被 MLST 分型的 89 株菌株中，groupI 的 30 株菌株有 20 株均缺失 inlA 基因 ;group11 的 57 株菌株中有 56 株三个基因均检出 ;groupl11 的菌株 hlyA、 inlA 和 ρlcB 三个基 因均未检出。结论 本文建立的三重实时荧光 PCR 方法能准确、快速、稳定的检测单增李斯特菌， 101 株单增李斯特菌的 hlyA 、 inlA 、 ρlcB 三个毒力基因的检出情况与单增李斯特菌的 MLST 分型聚类有较一致的关系，对分析单增李斯特菌毒力的 强弱有重要参考意义。 关键词:单增李斯特菌;TaqMan-MGB 三重实时荧光 PCR; 毒力基因分布:多位点序列分型 申图分类号:R378 文献标识码:A 文章编号: 1002 - 2694(20 16)05 - 451 - 06 Development of triplex TaqMan MGB-probe real-time PCR assay for detection of Listeria monocytogenes and the distribution of virulence gene in isolates LIU Er-longI , YUAN Mu-yun2 , LU Ying-zi I , CHEN Yin矿，W ANG Ping3 , XU Long-Yan2 , LI lia-qiI , ZHENG Gao-bingI , DU Ya-ping I , LIN Xue-qinI (1. Huangþu Entry-Exit Insþection and Quarantine Bureau , Guangzhou 510730 , China; 2. Guangdong Entry- Exit Insþection and Quarαntine Bureau , Guangzhou 510730 , China; 3. Chinese Academy of Insρection and Quarantine ,