westernblot各种液体配制.docVIP

一、所需试剂的配制 1、丙烯酰胺贮存液（30%Acr/Bic） 丙烯酰胺（Acr） 29.2g N，N-甲叉双丙烯酰胺（Bic） 0.8g 超纯水至 100ml 37度溶解，4度避光保存一个月，使用时恢复至室温且无沉淀。 2、分离胶缓冲液（4×）（1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8）： Tris（MW121.14）18.15g 超纯水 90ml 用HCl调pH值至8.8，最后用超纯水定容至100ml，4度保存。 3、浓缩胶缓冲液（4×）（1.0mol/L Tris-HCl，pH6.8）: Tris（MW121.14）12.1g 超纯水 90ml 用HCl调pH值至6.8，最后用超纯水定容至100ml，4度保存。 4、10%十二烷基硫酸钠（SDS） SDS 10g 蒸馏水至 100ml 50度水浴溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶解后仍可使用。 5、10%过硫酸铵（Aps） Aps 0.1g 超纯水 1ml 溶解后4度避光保存，保存时间为一周，现用现配，也可-20度保存 6、N，N，N，N-四甲基乙二胺（TEMED）：避光保存。 7、2×上样缓冲液（2×Loading Buffer）： 1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8） 0.8ml 10%SDS（电泳级） 2ml 溴酚蓝 0.5mg 甘油 0.8ml 2-巯基乙醇 0.2ml 蒸馏水 1.2ml 总量为5ml，可在4度存放数周，-20存放数月。（其中2-巯基乙醇可保护二硫键，并使蛋白下沉用利于电泳的进行。） 8、电泳缓冲液（pH8.3） Tris 3.03g 甘氨酸（Gly） 14.4g SDS 1g 或10%SDS 10ml 蒸馏水至 1L 无需调pH值（8.2~8.3），可在4度存放数周，次溶液可重复使用3~5次。 9、转移缓冲液： Tris 3.03g 甘氨酸（Gly） 14.4g 甲醇 200ml 蒸馏水至 1L 先用蒸馏水溶解甘氨酸和Tris，然后再加入甲醇，最后补足液体。无需调pH值（8.1~8.4），可在4度存放数周。（若蛋白分子量过大，可适当减少甲醇的浓度。） 10、TBS缓冲液 Tris 2.42g 氯化钠 29.2g 蒸馏水 900ml 溶解后，用HCl调pH值至7.5，最后用蒸馏水定容至1L，可在4度存放数周 11、TTBS漂洗液： TBS缓冲液 500ml TWEEN-20 0.5ml 混匀后即可使用，最好现用现配。 封闭液（5%脱脂奶粉） 脱脂奶粉 0.5g TTBS 10ml 混匀后即可使用，也可健壮成小包装-20保存，最好现用现配。 二电泳灌胶配方 浓缩胶（5%Acrylamide）配方表 各组分名称 各种凝胶体积所对应的各种组份的取样量（ml） 1ml 2ml 3ml 4ml 5ml 6ml 8ml 10ml 蒸馏水 0.68 1.4 2.1 2.7 3.4 4.1 5.5 6.8 30%Acrylamide 0.17 0.33 0.5 0.67 0.83 1.0 1.3 1.7 浓缩胶缓冲液 0.13 0.25 0.38 0.5 0.63 0.75 1.0 1.25 10%SDS 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08 0.1 10%AP 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08 0.1 TEMED 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.008 0.01 一般灌一块板用量为3ml 分离胶配方 一般来说灌一块板用量为5ml （1）6% 各组分名称 各种凝胶体积所对应的各种组份的取样量（ml） 5ml 10ml 15ml 20ml 25ml 30ml 40ml 50ml 蒸馏水 2.6 5.3 7.9 10.6 13.2 15.9 21.2 26.5 30%Acrylamide 1 2 3 4 5 6 8 10 分离胶缓冲液 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10 12.5 10%SD