重组人CLK1的真核表达及鉴定-国家药物筛选中心.PDF

生 物 技 术 通 讯 LETTERSINBIOTECHNOLOGY Vol.25No.4 Jul.,2014 455 doi: 10.3969/j.issn.1009-0002.2014.04.002 研究报告 重组人CLK1的真核表达及鉴定 1 1 1 1，2，3 1，2，3 李超 ，祖勉 ，连雯雯 ，刘艾林 ，杜冠华 1. 中国医学科学院北京协和医学院 药物研究所；2. 天然药物活性物质与功能国家重点实验室； 3. 药物靶点研究与新药筛选北京市重点实验室；北京 100050 ［摘要］ 目的：合成真核细胞CLK1（Cdc2-like kinase 1）编码基因，构建CLK1/pEGFP-N2真核表达载体并在真核细 胞HEK293A中过表达，为CLK1的生物学功能研究奠定基础。方法：从人脐静脉血管内皮细胞中提取总RNA，采用 RT-PCR技术用已知引物合成cDNA，将CLK1基因扩增后插入真核细胞表达载体pEGFP-N2，将重组质粒热转化至 大肠杆菌感受态Trans 10细胞中获得重组菌株，提取质粒进行酶切鉴定及插入基因测序；将构建的重组质粒转染 HEK293A细胞，用Western印迹及免疫荧光检测CLK1的表达水平，同时对其下游的磷酸化SF2/ASF蛋白进行检测。 结果：构建了CLK1/pEGFP-N2真核表达载体，将其转染HEK293A细胞后24 h，CLK1蛋白表达水平最高；同时，CLK1 过表达后使得下游的SF2/ASF蛋白磷酸化水平升高。结论：构建了人CLK1基因的真核细胞表达载体CLK1/pEGFP- N2，并在HEK293A细胞中过表达，其生物活性也得到了验证。本研究为外源性CLK1基因在真核细胞中过表达提供 了一种途径，为CLK1的生物学功能研究奠定了基础，也可为真核细胞其他蛋白表达体系的构建提供借鉴。 ［关键词］ Cdc2-like kinase 1；真核表达；重组质粒 ［中图分类号］ Q78 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1009-0002（2014）04-0455-05 Eukaryotic Expression and Identification of Recombinant Homo CLK1 1 1 1 1,2,3 1,2,3 LI Chao, ZU Mian, LIAN Wen-Wen, LIU Ai-Lin *, DU Guan-Hua * 1. Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences Peking Union Medical College; 2. State Key Laboratory of Natural Active Substances and Functions; 3. Beijing Key Laboratory of Drug Target Research and Drug Screening; Beijing 100050, China *Co-corresponding authors, LIU Ai-Lin, E-mail: liuailin@imm.ac.cn; DU Guan-Hua, E-mail: dugh@imm.ac.cn ［Abstract］Objective: To investigate synthesis of the gene sequence encoding eukaryotic Cdc2-like kinase 1 （CLK1）, construction of the eukaryotic vectors CLK1/pEGFP-N2 and its over-expression in HEK293A cells. This work provides guideline for rese