crispr原理解析讲稿.pptxVIP

CRISPR;CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，其序列由一个前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区(Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。 Leader一般位于CRISPR簇上游，是富含AT长度为300～500bp的区域，被认为可能是CRISPR簇的启动子序列。 Repeat长度为21～48bp，含有回文序列，可形成发卡结构。重复序列之间被长度为26～72bp的间隔区隔开。 Spacer区域由俘获的外源DNA组成，类似免疫记忆，当含有同样序列的外源DNA入侵时，可被细菌机体识别，并进行剪切使之表达沉默，达到保护自身安全的目的。;crRNA：当细菌抵御噬菌体等外源DNA（ protospacers ）入侵时，在前导区的调控下，CRISPR被转录为长的RNA前体(pre-crRNA)，然后加工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成熟crRNA，pre-crRNA转录的同时，与其重复序列互补的反式激活crRNA (Trans-activating crRNA，tracrRNA)也转录出来。 sgRNA：CRISPR基因敲除敲入系统中重要的组成部分，早先发现的guide?RNA，由tracrRNA和crRNA两部分组成,?两部分融合表达后，即sgRNA也能很好的行使guide的功能，与cas9蛋白结合，引导cas9酶靶向基因组DNA进行剪切。;Cas： CRISPR簇的侧翼序列分析发现，在其附近存在一个多态性家族基因。该家族编码的蛋白质均含有可与核酸发生作用的功能域(具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性)，并且与CRISPR区域共同发挥作用，因此被命名为CRISPR关联基因(CRISPR associated)，缩写为Cas。 PAM： （protospacer adjacent motif ）protospacers选择自入侵DNA旁出现PAM的区域，剪切位点位于crRNA互补序列下游邻近的PAM区。 ;工作原理： crRNA( CRISPR-derived RNA )通过碱基配对与 tracrRNA (trans-activating RNA )结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA (short guide RNA )，引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。;第一阶段：外来DNA采集 宿主通过Cas蛋白来识别外源核苷酸，使入侵细菌的短片段DNA作为间隔区序列插入到宿主的CRISPR位点。; 第二阶段：CRISPR?RNA的生物合成 CRISPR RNA的生物合成从转录开始，接下来是初级转录产物pre-crRNA加工生成一类短的CRISPR衍生RNAs（crRNAs），每一个都包含与之前遇到的外源DNA（Spacer序列）对应的互补序列。 pre-crRNA转录的同时，与其重复序列互补的反式激活crRNA (Trans-activating crRNA，tracrRNA)也转录出来，这两个RNAs可以融合成一个sgRNA。;第三阶段：靶向干扰 crRNA、tracrRNA和Cas9组成复合体，识别并结合于crRNA互补的序列，然后解开DNA双链，形成R-loop，使crRNA与互补链杂交，另一条链保持游离的单链状态，然后由Cas9中的HNH活性位点剪切crRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链，最终引入DNA双链断裂(DSB)。;数据： genome-scale CRISPR-Cas9 knockout (GeCKO) library targeting 18,080 genes with 64,751 unique guide sequences. The GeCKO v2 libraries consist of?over 100,000 unique gRNAs?for gene knock-out in either the human or mouse genome.? ;敲除AIP1基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统,成功获得AIP1敲除的人(胚肾细胞株)293T稳定细胞株（广州医科大学） 在一个黑素瘤模型中，筛选出了涉及药物维罗非尼（Vemurafenib）耐药性的基因（麻省理工学院 张峰） ; CRISPR/Cas9的靶向特异性是由两部分决定的，一部分是RNA嵌合体和靶DNA之间的碱基配对，另一部分是Cas9蛋白和一个短DNA基序（DNA motif）的结合，这个短DNA