京枣试管苗染色体稳定性策略分析.docVIP

京枣试管苗染色体稳定性策略分析 　　　植物组织培养技术已广泛应用于珍贵种质资源的离体保存、优良体细胞无性系变异材料的创建以及物种库的建立和保存，因而研究组培试管苗能否稳定遗传具有很大的应用价值。目前，国内外关于山葡萄[1]、芥蓝[2]、百合等[3～6]品种组培苗遗传稳定性的报道有许多，但关于枣树组培苗遗传稳定性的研究较少[7～10]。本试验旨在通过探讨京枣组培苗的遗传稳定性，为枣树组培苗的快繁、生产和推广提供理论依据与指导。 　1材料与方法 　1.1试验材料与试剂 　供试材料为京枣（Zizyphus jujuba Mill. Jingzao）试管苗，由陕西省延安大学红枣繁育工程重点实验室提供，取继代培养20代后经生根培养基生根的京枣试管苗根尖用于染色体观察。 　用于染色体制片的主要试剂有饱和对二氯苯溶液、改良苯酚品红染液、0.075 mol/L氯化钾溶液。 　1.2培养基和培养条件 　试管枣苗生根培养基（S15）：1/2 MS+1.0 mg/L IBA +0.02 mg/L NAA +20%蔗糖+0.55%琼脂。 　培养条件：温度为24～27℃，相对湿度为60%～65%，光照强度为1 500～2 000 lx。 　1.3材料准备与取样 　根据试管苗的长度，将继代培养的京枣试管苗剪成2～4 cm的茎段，转接到S15生根培养基，接种后第3天统计生根的试管苗数，以后每隔5天统计生根数。 　取样：取刚长出1.5～2.0 cm长的根，此时根分生能力最旺盛，最适合于染色体观察。取样时间：上午9时。 　1.4材料处理 　（1）预处理：将所取材料浸入饱和对二氯苯溶液，振荡培养箱常温振荡4 h。 　（2）固定：预处理后，用蒸馏水将材料清洗3次，每次3～5 min，再用现配的Carnoys固定液（无水酒精∶冰醋酸=3∶1）常温下固定12 h。 　（3）前低渗：固定后的材料用蒸馏水清洗3次，每次3～5 min，然后用滤纸将材料上的水分吸干，放入0.075 mol/L KCl溶液中30 min，15 min换液一次。 　（4）解离：将材料置于1 mol/L HCl中60℃恒温水浴加热，根尖解离时间不宜过长，一般为10 min，解离充分的标志是组织间有大量气泡，解离后的材料用镊子夹出迅速放入1 mol/L冷盐酸中浸泡30 s。 　（5）后低渗：经冷盐酸浸泡后，蒸馏水清洗3次，每次3～5 min，放入0.075 mol/L KCl溶液中60 min，30 min换一次溶液。 　（6）染色：用改良苯酚品红染液染色24 h。 　（7）压片：选取材料分生最旺盛的部分（一般为未展开叶片的叶原基、茎尖的分生组织），用解剖针取肉眼刚好能看清的一小块组织，放在洁净的载玻片上，盖上盖玻片（中间不能有气泡）。 　（8）脱水：将染色压制好的制片，倒放在盛有45%醋酸+95%酒精（V∶V=1∶1）的培养皿中，使载玻片稍倾斜（一边垫上一玻棒），经5～10 min，可见盖玻片从载玻片上脱离，用吸水纸吸去载玻片和盖玻片边上多余的酸液，再依次经过以下浓度梯度的酒精：20%、30%、50%、70%、85%、95%、100%，每个浓度停留30 min。 　（9）透明：经过以下步骤：1/3二甲苯﹢2/3纯酒精 rarr;1/2二甲苯﹢1/2纯酒精rarr;2/3二甲苯+1/3纯酒精rarr;纯二甲苯，逐步进行，每步3 min，使材料既除去酒精，又不收缩变形。 　（10）封藏：将玻片从二甲苯中取出，在标本上滴光学树胶（树胶的量以盖上盖玻片后刚好铺满为合适），然后盖上一同处理的盖玻片（中间没有气泡）。将封好的玻片标本在恒温培养箱中40℃烘烤至干燥，贴上标签，即可永久保存。 　（11）镜检：40times;10倍光学显微镜观察约60个比较清晰的分裂相细胞，鉴定其中的染色体数目，进行OLYMPUS显微照相。 　2结果与分析 　对60个根尖细胞进行染色体计数分析，从表1可以看出，京枣根尖染色体数目2n=24的占85%，百分数检验差异极显著，说明京枣继代培养20代的组培苗染色体数目未发生变化，即表现稳定遗传。染色体图见图1。 　3讨论 　3.1染色体制片方法的探讨 　3.1.1解离时间和温度的把握 枣树细胞的细胞壁比较厚，解离时间不能太短，时间太短，会使解离不彻底，染色效果不好，甚至染不上色；但也不能太长，否则酸会水解染色体中的蛋白质，使染色体受损，难以得出正确的实验结果。因此，在解离时，要注意随时观察组织的解离状况，有大量气泡即说明解离充分，一般为10 min。解离温度要控制在60℃，温度过高会使酸解离速度加快，导致解离的进程不能被很好的控制。因此，本试验采用两支温度计，一支测解离直管内的实际温度，一支测定管外水温，从而准确控制