嗜水气单胞菌对氟苯尼考耐药性获得及消失速率.docVIP

嗜水气单胞菌对氟苯尼考耐药性获得及消失速率 当前，防治嗜水气单胞菌性疾病的主要手段是使用化学药物[1]。然而，我国对鱼类的抗菌药物的药效学及药物代谢动力学等基础研究的薄弱，加上养殖者轻预防重治疗，不针对病原的盲目用药和未进行药敏实验的滥用鱼药，导致嗜水气单胞菌耐受的抗菌药物种类日益增多，对抗菌药物的耐受剂量越来越强。目前，嗜水气单胞菌对上世纪60年代开始使用的磺胺类药物敏感率不足20%[2]，对上世纪80年代开始使用的喹诺酮类药物的敏感率已从100%下降到40%～60%[3]。 氟苯尼考又称氟甲砜霉素，是一种新型的动物专用的氯霉素类广谱抗生素。20世纪80年代末研制而成，1990年在日本首先用于水产养殖业，之后在世界范围内广泛上市。我国于1999年批准氟苯尼考为国家二类新兽药，最早用于水产养殖上治疗鳗鲡爱德华氏菌病和赤鳞病[4]，目前，已在水产业广泛应用，主要用于防治鱼类的各种细菌性疾病。为避免氟苯尼考重蹈磺胺类药物和喹诺酮类药物的覆辙，本文开展嗜水气单胞菌对氟苯尼考的耐药性获得和消失速率研究，为科学规范氟苯尼考的使用提供依据。 1材料和方法 1.1材料 3株嗜水气单胞菌菌株为2013年5月从北京怀柔发病的养殖鲟鱼上分离获得，纯化后经API鉴定系统和16S rDNA鉴定为嗜水气单胞菌，分离部位分别为肝、脾、肾，编号1、2、3。Mulluer-Hinton肉汤（MHB）购于北京陆桥技术有限责任公司，脑心浸液琼脂（BHIA）购于英国OXOID公司。氟苯尼考购于美国Sigma公司，用甲醇溶解后，用蒸馏水稀释，制备浓度为2 560 mu;g/mL，经0.2 mu;m滤膜过滤除菌后，作为母液备用。 1.2方法 1.2.1菌株最小抑菌浓度的测定采用临床实验室标准化委员会(CLSI)推荐的浓度稀释法（NCCLS，2010）。操作方法为：菌株接种至BHIA平板，置于28 ℃培养16～20 h后，采用045%无菌生理盐水制成0.5麦氏浊度菌悬液，稀释100倍备用。使用母液和无菌MHB培养基制备氟苯尼考浓度梯度，浓度分别为0.5 mu;g/mL、0.8 mu;g/mL、1.3 mu;g/mL、2.0 mu;g/mL、3.2 mu;g/mL、5.0 mu;g/mL、8.0 mu;g/mL、12.7 mu;g/mL、20.2 mu;g/mL、32.0 mu;g/mL，每管3.0 mL，每管加备用的菌悬液100 mu;L，无菌塞封口后于28 ℃培养48 h，记录最小抑菌浓度（MIC）。 1.2.2一定氟苯尼考浓度压力下菌株MIC随时间的变化制备氟苯尼考浓度为0.4 mu;g/mL灭菌MHB培养基，灭菌试管分装成5 mL/管。每株菌接种9支试管，每管接种100 mu;L备用菌悬液。加灭菌塞子，置于28 ℃生化培养箱中孵育，每天早、中、晚对试管摇匀。每天取一管，按1.2.1方法测定菌株的MIC值。 1.2.3菌株对氟苯尼考的耐药性获得速率测定菌株的MIC后，从肉眼观察有细菌生长的最高药物浓度的试管中吸取100 mu;L培养基，将其接种在不同氟苯尼考浓度的MHB培养基试管中，28 ℃孵育48 h；再从肉眼观察有细菌生长的最高药物浓度的试管中吸取100 mu;L培养基，接种至不同氟苯尼考浓度的MHB培养基试管中，28 ℃孵育48 h。连续操作7次。使嗜水气单胞菌在含有氟苯尼考的药物培养基中传代7次，比较最后测定的MIC与最初的MIC比较，评价菌株对氟苯尼考的耐药性获得速率。 1.2.4菌株对氟苯尼考的耐药性消失速率将1.2.3选出的已获得较高耐药性的菌株，以琼脂内穿刺法将菌株分别接种在盛有不含氟苯尼考的BHIA培养基中,在4 ℃条件下保存,测定放置1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、28 d后，菌株的MIC值。同时，采用不含氟苯尼考的BHIA平板传代，连续传代7次，测定每次传代后菌株的MIC值。将菌株4 ℃放置28 d的MIC值及传代7次后测定的MIC与最初的MIC比较,评价菌株对氟苯尼考耐药性消除速率。 2结果 2.1一定浓度的氟苯尼考压力下菌株MIC随时间的变化规律 在一定浓度的氟苯尼考压力下，氟苯尼考对3株嗜水气单胞菌的MIC均呈现先逐步上升之后稳定的趋势。经0.4 mu;g/mL的氟苯尼考作用4～5 d，嗜水气单胞菌对氟苯尼考的耐药浓度升高2.0～2.5倍。见表1。 2.2菌株对氟苯尼考的耐药性获得速率 3株嗜水气单胞菌经连续7次在带有氟苯尼考的培养基中传代培养，菌株对氟苯尼考的耐药性变化情况见表2。由表2可以看出3株嗜水气单胞菌在含有氟苯尼考的培养基中传代7次后，均获得了较强的耐药性。3株嗜水气单胞菌的MIC分别从0.8 mu;g/mL上升到了12.7 mu;g/mL、32.0 mu;g/mL和20.2 mu;g/mL，分别上升了15.9倍、