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杨树EBP1基因克隆及表达载体构建模型试分析 摘要：器官大小是植物形态的重要表现特征之一，也是决定一些作物或经济植物产量和品质的重要因素。研究证实，草本植物如拟南芥中EBP1类转录因子可从细胞数量和体积2个方面同时调控植物器官大小，但该基因在木本植物杨树中的结构及功能仍未知。本研究依托杨树全基因组及EST数据信息，采用生物信息学方法结合基因同源序列克隆，首次对杨树中的EBP1全长cDNA进行克隆及序列分析，同时成功构建了用于遗传转化的过表达载体。 　　关键词：杨树;EBP1基因;克隆;表达载体;构建;基因序列分析;蛋白同源性比对 　　中图分类号： Q943.2 文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2015）04-0014-03 　　收稿日期：2014-05-25 　　基金项目：天津市高等学校科技发展基金（编号;天津市应用基础与前沿技术研究计划（编号：14JCQNJC15000）。 　　作者简介：李 慧（1981—），女，河北廊坊人，硕士，讲师，主要从事植物分子生物学研究。E-mail：lihui@。 　　通信作者：阎国荣，博士，教授，主要从事植物资源学研究。E-mail：yanguorong@。 　　自然界中植物种类繁多、形态各异，其中器官大小是造成植物形态多样性的主要因素之一。不同植物间器官大小可能存在显著差异，但就同一物种内相同基因型的不同植物个体而言，在相同的生长环境下它们的器官大小基本一致，表明植物各器官最终大小的形成受到严格的遗传调控[1]。因此，近年来从不同植物中挖掘参与器官大小发育调控的基因或转录因子并揭示其调控机制的研究备受关注，并已在拟南芥和一些农作物如水稻、玉米、油菜、番茄、马铃薯等中取得了长足的研究进展[1-2]。有研究发现，在外界生长条件一致的情况下，植物各器官的最终大小在细胞水平上受细胞数量和大小的协同控制[3]。因此，分离、克隆参与调控植物细胞数量和大小的基因并阐释其功能是揭示植物器官大小发育控制机制的关键。目前，在拟南芥等草本植物中已有多个相关基因和转录调控因子被成功分离和克隆。有研究表明，AINTEGUMENTA（ANT）[4]、ANGUSTIFOLIA3（AN3）[5]、GROWTH-REGULATING FACTOR5（AtGRF5）[5]、GRF-INTERACTING FACTOR（GIF）[6-7]、JAGGED（JAG）[8]、STRUWWELPETER（SWP）[9]、SWELLMAP1（SMP1）[10]、KLUH（KLU）[11]、EBP1[12]及Auxin-Regulated Gene involved in Organ Size（ARGOS）[13-14]等主要通过正向调控细胞增殖能力控制器官内细胞数量，进而影响器官大小。这些基因的异位过表达可通过延长细胞增殖时间导致植物器官变大，而突变则会导致植株器官整体变小。另外，还有一些基因通过调控细胞大小来影响器官的大小，如ARGOS-LIKE（ARL）[15]、ROTUNDIFOLIA3（ROT3）[16]、AtGRF1/2[17]、BIGPETAL[18]、AtTOR[19]、ORGAN SIZE RELATED1（OSR1）[20]等，其中拟南芥中EBP1被证实对植物细胞数量和大小均能发挥正向调控作用[12]。拟南芥EBP1是和人类的ErbB-3表皮生长因子受体结合蛋白同源的一个基因，与核糖体的生物合成相关，该基因在进化上具有较高的保守性。目前除在拟南芥外，在沙冬青和马铃薯中也有该基因序列的相关报道，但该基因在其他植物中的功能仍未知，特别是在木本植物中，尚未有该基因的相关报道。因此，本研究对杨树中EBP1基因进行克隆，并对其表达载体进行构建。相关研究对进一步揭示杨树EBP1的功能具有重要意义，同时对采用基因工程等手段提高林木产量和品质具有潜在的应用价值。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　黑杨（Populus nigra），种植于南开大学校园内;pEASY-T1载体，购于北京全式金生物技术有限公司;植物表达载体pBI121、农杆菌LBA4404，均由笔者所在实验室保存。 　　1.2 方法 　　1.2.1 黑杨总RNA提取及反转录 采用改良的CTAB法提取黑杨叶片总RNA，以Oligo dT（18）为逆转录引物，在 M-MLV 作用下逆转录成cDNA。 　　1.2.2 引物设计及同源克隆 以拟南芥及其他草本植物中已经报道的EBP1基因DNA及cDNA序列为种子序列，利用Blast序列比对软件搜索杨树基因组及EST数据库，获得杨树中候选EBP1基因序列。随后根据筛选、获得的杨树中EBP1候选序列设计引物，进行扩增，并对扩增结果进行测序验证。进一步对NCBI数据库中收集的杨树EBP1