橡胶树AFLP银染体系建立前期准备.docVIP

橡胶树AFLP银染体系建立前期准备 　摘　要：以橡胶树杂交群体为材料，来寻找适合于研究橡胶树的AFLP技术体系的建立，优化是在多方面原因的，在众多关键因素的影响中，其中优化的关键前提为质量较高的基因组DNA。本实验采取CTAB改良法提取DNA为橡胶树的AFLP技术后续工作顺利开展打下基础。 关键词：基因组DNA提取； AFLP 　　 中图分类号 S 794.1 文献标志码 B Rubber Tree AFLP Silver-staining System Preparation Wang Huijun Abstract Rubber tree hybridization groups as the material, to find suitable for the study of rubber tree AFLP technology system establishment, optimization is in many reasons, in many of the key factors, which optimizes the key premise for high quality genomic DNA. This experiment takes CTAB modified method for extraction of DNA rubber tree AFLP technology to lay a foundation for follow-up work is carried out smoothly. KeywordsExtraction of genomic DNA； AFLP AFLP[1]技术，又称扩增片断长度多态性，是基于RFLP和PCR相结合的DNA分析技术。AFLP多态性强，非常适合遗传多样性分析、快速遗传图谱构建等研究。橡胶树是多年生的高大乔木，育种周期长已成为制约橡胶树品种选育的关键因素。突破了选育技术将给橡胶树的更新换代得以实现。现代分子水平研究的生物技术给橡胶树的筛选优良基因、缩短育种年限提供了理论基础，来实现多年生高大乔木部分优良基因，如抗寒、抗病基因提前选育可能性。用AFLP分子标记技术首先为橡胶树育种提供相应的分子辅助手段。但操作技术要求上高于其他方法，由于该技术实验步骤比较繁杂，许多因素会直接影响AFLP分析的效果。因此需要提取质量较高的基因组DNA用来适合于橡胶基因组AFLP标记分析的技术体系研究。 1材料与方法 1.1材料和仪器 橡胶树群体（GT1×873）、Tag酶等。仪器：离心机、PCR仪、电泳仪、恒温水浴锅。 1.2方法介绍 1)CTAB区室法[2]：CTAB对于细胞有分割作用，对于杂质和多酚类物质有很好的隔离特性，只要在细胞裂解之前，保持细胞内渗透电势平衡的平衡液，制止了细胞核核膜的破裂，加入CTAB可以很好对DNA进行提纯。2)高盐低pH[3]法：在酸性介质中，采用高浓度的盐情况下，减少了多酚类的电离，同时避免这些物质的进一步氧化。同时蛋白质在高浓度盐KAC和降低温度条件下可以加速沉淀。用高盐低pH法广泛适用于次生代谢产物含量低的一些材料，对于去除蛋白质和多酚的效果较好。3)核DNA法[4]：多糖存在会严重影响酶的活性，核DNA法是利用低速离心和破壁技术后，把粗细胞核分离出来，首先除去干扰物质如多糖、酚类物质。这些步骤将减少对DNA的污染，提高DNA的质量。4)CTAB改良法：作为阳离子去垢剂的CTAB可以与核酸形成复杂复合物，在盐浓度较高的情况下该复合物可溶，当稀释降低盐浓度到一定量时，该复合物将从溶液沉淀。通过离心机离心后将核酸复合物与多酚和蛋白质分离。在有异丙醇或乙醇的情况下把DNA沉淀释放出来。5) SDS法：在温度范围在55度到65度的高温条件下，SDS作为一种阴离子去垢剂，他可以使蛋白质变性，同时也使染色体解析。这样使多糖和蛋白质与SDS形成复杂的结构，生成复合物从而把核算解析出来。用SDS法提取出的DNA比较多，同时对核酸的破坏较小，该法简单易操作。 2模板DNA的比较 用将上面的5种方法分别提取基因组DNA，同时将５种方法提纯的DNA进行比较，我们将测定结果加以对比。用改良CTAB法和核DNA法提取的效果比较好，基因组DNA提取物都为白色，浓度也比较高。用SDS法提取基因组DNA的浓度较高，但是DNA提取物中有杂色，略带黄色；对于CTAB区室法和高盐低PH法提取的基因组DNA浓度、得率都偏低，同时CTAB区室法提取的基因组DNA还带有杂色，分析原因可能是多酚类杂质没能去除干净。综上分析，5种提取法对植物的色素、多糖、多酚类杂质的去除效果各不同，其中SDS的去除效果最差，而核DNA法可以有效去除抑制酚类、色素杂质的