猪SLA—DRB1基因外显子3单核苷酸多态性及其及PRRSV.docVIP

猪SLA—DRB1基因外显子3单核苷酸多态性及其及PRRSV 　摘要：SLA-DRB1是影响猪体免疫反应、疾病感染和疫苗应答的重要因子。本研究对猪SLA-DRB1基因外显子3序列进行扩增和测序，筛选多态性位点，分析其与PRRSV（猪繁殖与呼吸综合征病毒）易感性的相关性。测序发现SLA-DRB1基因外显子3存在4个单碱基突变（g.17G/A、g.95C/T、g.137G/C和g.232G/C）。针对g.232G/C建立PCR-RFLP方法，检测6个猪种群共227个样本，发现在大白姜曲海杂交猪、姜曲海猪、长白猪、定远猪和杜洛克猪中有GG（0.43，0.80，0.59，0.54，0.83）和GC（0.57，0.20，0.41，0.46，0.17）2种基因型，其他群体均为GG 型。不同基因型猪肺泡巨噬细胞中PRRSV拷贝数在接毒后6、12、18、24、36 h差异均不显著（Pgt;0.05），不同基因型猪血液中病毒载量在接毒后4、7、11、14、21、28、35、42 d差异均不显著（Pgt;0.05），不同基因型对猪体质量和日增质量的影响不显著（Pgt;0.05）。提示SLA-DRB1的g.232G/C突变与 PRRSV抗性无显著关联。　　关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；SLA-DRB1基因；外显子；PCR-RFLP；易感性；碱基突变　　中图分类号： S858.285.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0041-04　　收稿日期：2015-04-08　　猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是一种高度传染性疾病，以母猪繁殖障碍和仔猪的呼吸道疾病为特征，造成怀孕母猪流产、产死胎和仔猪的高死亡率等[1]。其病原猪繁殖与呼吸综合征病毒（ PRRSV）具有高度变异性、抗体依赖性复制增强、巨噬细胞嗜性和持续性感染等特征[2]，导致现有的疫苗不能很好地控制PRRS的流行，PRRS的防治仍然是养猪业头等难题之一[3-4]。因此，猪对PRRSV的抗性也日益受到关注。国外已有多个课题组分别在体内外研究了PRRSV在不同猪种肺泡巨噬细胞（PAM）中复制和生长的特征，发现猪对PRRSV抗性或易感性存在品种（系）间的遗传差异[5]。Murtaugh 等研究了猪对PRRSV的免疫应答，指出疾病的严重性在猪品种间和群体间存在变异[6]。Ait-Ali等的研究表明PRRSV在来源于长白猪的PAM中的复制相对于其他商业遗传品系包括大白猪、皮特兰和另外2个合成系显著延迟、缓慢，然而，关于猪PRRSV抗性的遗传机制尚不清楚[7]。　　猪的主要组织相容性复合物（MHC）即猪白细胞抗原（SLA），它是由紧密连锁、高度多态的基因位点所组成的染色体上的一个遗传区域，其基因产物为MHC抗原，主要功能是抗原递呈，与动物的抗病性有着密切的关系[8]。SLA按其抗原结构和功能主要分为3大类，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类，SLA-DRB1属于Ⅱ类分子。目前，国内外对SLA-DRB1基因的研究主要集中在第二外显子多态性的研究上。张冬杰等通过对 SLA-DRB1 基因整个编码区进行分析，发现突变大多集中在第二外显子处，其他3个外显子突变较少[9]。徐如海等研究表明，SLA-DRB1近端调控区存在24个多态位点，其中 G-146T 位点与仔猪大肠杆菌K88ab黏附表型存在显著的关联[10]。　　Arceo等对200头杂交猪进行PRRSV攻毒时发现，高病毒载量低体质量增加组相对于低病毒载量低体质量增加组SLA-DRB1基因表达量降低，提示SLA-DRB1可能在猪抗PRRSV过程中发挥重要作用[11]，但SLA-DRB1基因多态性与猪PRRSV抗性是否关联还未见报道。本研究对2个外来猪种、3 个地方猪种和1 个杂交猪种群SLA-DRB1基因的外显子3进行测序，寻找多态性位点，同时分析其与PRRSV易感性的相关性，以期检测到与PRRSV易感性相关的分子标记，为PRRSV抗性育种提供试验依据。　　1材料与方法　　1.1材料　　试验猪包括6个品种（或群体），共227头，其中大白姜曲海猪115头（江苏姜曲海种猪场）、姜曲海猪10头（江苏姜曲海种猪场）、长白猪37头（杭州大关猪场）、大白猪24头（杭州大关猪场）、定远猪11头（安徽省定远县猪场）、杜洛克猪30头（杭州大关猪场），每个个体取耳组织于冻存管中，置于-80 ℃中保存。PRRSV- NJGC株由江苏省农业科学院兽医研究所提供。　　1.2方法　　1.2.1组织样 DNA 提取耳组织样的DNA提取采用酚/氯仿抽提法，然后于-20 ℃ 保存备用。　　1.2.2SLA-DRB1基因外显子3扩增参照猪SLA-DRB1基因外显子序列设计引物DRB-g3，由上海捷瑞公司合成，引物信息见表1。表1引物序列、复性温度及产物大小　　引物名称 引物序列（5pri