珍稀濒危植物宝华玉兰ISSR—PCR反应体系建立及优化.docVIP

珍稀濒危植物宝华玉兰ISSR—PCR反应体系建立及优化 　摘要：为建立和优化宝华玉兰（Magnolia zenii Cheng）ISSR-PCR反应体系，采用正交试验和单因子试验方法对影响PCR扩增体系中的Mg2+、dNTPs、DNA模板、引物和Taq聚合酶一定浓度的用量5个因子进行分析比较。结果显示，宝华玉兰ISSR-PCR 25 mu;L反应体系中的5个因子最佳水平分别为DNA模板（20 ng/mu;L） 3.5 mu;L，引物（10 mu;mol /L） 1.25 mu;L，Taq聚合酶（5 U/mu;L） 0.2 mu;L，Mg2+（25 mmol/L） 2.0 mu;L，dNTPs（2.5 mmol/L） 0.8 mu;L。宝华玉兰ISSR-PCR反应的最优体系建立，为进一步利用ISSR对其进行分子标记辅助育种、分子身份证构建和遗传多样性分析等后续研究奠定了基础。　　关键词：宝华玉兰（Magnolia zenii Cheng）；ISSR-PCR反应体系；种质资源保护　　中图分类号：Q949.747.1+2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）16-4206-04　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.16.034　　宝华玉兰（Magnolia zenii Cheng）是木兰科（Magnoliaceae）珍贵园林观赏植物，在每年的3～4月开花，其芳香艳丽、姿态优美，有极高的观赏价值。但其仅产自江苏省句容县宝华山，数量较少，已被列为国家二级重点保护植物。由于宝华玉兰产地单一，对于环境的要求特别严格，所以人工栽培并成功的事例很少，同时由于林下灌木层不断被破坏，没有更新苗木，现已处于濒危状态[1]。面对如此严峻的形势，开展对宝华玉兰的遗传多样性分析研究、制定具有针对性的种质资源保护策略刻不容缓。简单序列重复区间扩增多态性（Inter-simple sequence repeats，ISSR）是由加拿大蒙特利尔大学Zietkiewicz等于1994年创建的一种分子标记技术[2]，ISSR分子标记技术兼具SSR、RAPD、RFLP、AFLP等分子标记的优点，与其他技术相比，ISSR不需要预先获知序列信息而使成本降低，且多态性更丰富；并且重复性高、稳定性好，同时具备简便、易操作等特点；相比之下，ISSR更快捷、成本较低、DNA用量小、安全性较高[3]。由于上述优点，ISSR在植物种质资源研究尤其是种质资源的收集和鉴定、遗传多样性分析和亲缘关系鉴别及基因定位等方面得到了广泛的应用[4-9]。　　目前对宝华玉兰的研究，仅在形态学、生物生态学特性、生存现状、文献考证、群落学分析等方面有过初步研究和探索，对该物种在分子水平上的遗传多样性分析至今尚未见报道。试验通过正交试验和单因子试验，分析DNA模板、Taq聚合酶、引物、Mg2+和dNTPs 5个因子用量对宝华玉兰ISSR-PCR反应的影响，建立宝华玉兰最优ISSR-PCR反应体系，以期为利用ISSR标记对其进行分子标记辅助育种、分子身份证构建和遗传多样性分析等后续研究奠定基础。　　1 材料与方法　　1.1 材料　　试验所需的宝华玉兰活体材料采自江苏省句容县宝华山。采取植物叶片后用硅胶快速干燥，妥善保存后送回南京森林警察学院实验室。　　1.2 方法　　1.2.1 宝华玉兰DNA提取 取硅胶干燥的植物叶片0.1 g，用研钵研磨粉碎，采用改良的十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）法抽提基因组DNA[10]。DNA的浓度和质量采用紫外分光光度法和1%琼脂糖凝胶电泳法检测。　　1.2.2 宝华玉兰ISSR-PCR反应引物筛选 引物参照加拿大哥伦比亚大学（UBC）网站公布的第九套ISSR引物序列进行合成。从100个ISSR引物中随机选择12条引物803、816、826、834、842、848、857、863、875、886、890、897进行目标引物的筛选。初反应体系为25 mu;L，其中Taq聚合酶（5 U/mu;L） 0.2 mu;L，Mg2+（25 mmol/L） 2 mu;L，DNA模板（20 ng/mu;L） 2 mu;L，dNTPs（2.5 mmol/L） 2 mu;L，引物（10 mu;mol/L） 1 mu;L，MilliQ水15.3 mu;L。扩增程序为：95 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共36个循环；72 ℃延伸10 min。采用1%琼脂糖凝胶电泳进行扩增产物检测。　　1.2.3 宝华玉兰ISSR-PCR反应体系建立 对宝华玉兰ISSR-PCR反应的5因素（Taq酶、Mg2+、DNA模板、dNTPs、引物）4水平（浓度）设置正交试验L16（45），共16个处理，