新编 微生物手册1228.docVIP

一、微生物操作基本知识 1、玻璃器皿的准备 1.1清洗 一般的玻璃器皿可用毛刷及洗涤剂去灰、尘油垢、无机盐等物质，再用自来水冲洗，然后用蒸馏水洗2～3次，将器皿倒叩备用。 用过的玻璃器皿需高压灭菌20分钟或在5%的碱液里煮沸数分钟后，刷洗。 洗涤剂常用洗衣粉、肥皂，对一些还原性或有机物污垢，可用重铬酸钾清洗。 重铬酸钾清洗液配方： 浓配方 重铬酸钾40g 自来水160ml 浓硫酸800ml 稀配方 重铬酸钾50g 自来水850ml 浓硫酸100ml 1.2玻璃器皿的包扎 1.2.1试管 洗净、干燥的试管，塞上棉塞，棉塞入管2/3，管外留1/3，同规格的数支试管用棉绳捆扎在一起，试管上半部分外包牛皮纸，再用棉绳捆扎紧后灭菌。 1.2.2移液管 先把移液管吸的一头塞上少量脱脂棉，然后每支吸管用片宽约5cm的长纸条，以约450的角度螺旋形紧卷起来，吸管尖端在头部用纸条卷包，口吸端用剩余纸条折叠打结，装入盒内干热灭菌备用。 1.2.3培养皿 10个培养皿一组叠放在一起，装入培养皿筒内，干热灭菌备用。 1.2.4三角瓶 三角瓶每个需要单独塞好棉塞，用牛皮纸包扎棉花塞头部，用棉绳扎紧灭菌。如果瓶内装有待灭菌的物质如培养基、生理盐水等，应注明。 2、灭菌 微生物检验的整个过程都必须在严格的无菌条件下进行，各种检验用具必须经过无菌处理。 2.1实验室常用的灭菌方式 2.1.1化学灭菌 此法适用于微生物操作过程中不能用加热、紫外线的地方，如人手、操作台、取样台等。 75%酒精溶液 5%石炭酸（苯酚） 1～2%甲醛（福尔马林）液：用于熏蒸室内空气 5%高锰酸钾溶液 2.1.2物理灭菌 紫外灯灭菌 用于无菌室的台面和空气灭菌，打开紫外灯30分钟后，关闭紫外灯，待30分钟后方可进入无菌室。 火焰灭菌 直接在火焰上燃烧灭菌,如接种用具(针、环、涂布棒等)，灼烧取样口，试管、三角瓶口等。 干热法 在恒温干燥箱里进行，在180℃恒温下，保持300分钟，此方法适用于一般玻璃器皿、金属等耐热物品。 高压蒸汽灭菌 在密闭的高压灭菌锅内，由于增加灭菌锅内的压力，使水的沸点上升，达到比高于100℃的蒸汽，从而达到灭菌效果。 采用高压灭菌锅，一般为0.107Mpa(121℃)，15～20min，含糖高的培养基应采用0.072Mpa， 15～20min。 煮沸灭菌 灭菌物品在沸腾蒸馏水中煮沸0.5小时，（如集菌法采用的膜）或在蒸锅内利用蒸汽灭菌0.5小时（如风取样器），可达到灭菌效果。 3、无菌室要求： 3.1无菌室高度：2.2-2.5m； 3.2 紫外灯配置：30w/10－15m2； 3.3 地面、墙壁、设备表面杀菌：采用浓度为75％75％乙醇的棉球对手及前臂进行彻底消毒。 1.4.2缓慢开启手动采样阀，排出采样管线内的残液,关闭采样阀。 1.4.3用含有75％乙醇的脱脂棉球对取样点及其周围进行初步消毒。再使用便携式燃气喷枪，对取样点进行快速火焰灭菌（30秒）。 1.4.4小心开启手动取样阀，使液体流出（20秒）以对取样阀进行冷却，然后把取样阀开小，在无菌状态下让样品注入取样瓶中（取样量不少于150ml）。 1.4.5关闭取样阀，并对样品做好标识。 注意事项：采自来水时因管道较长，应排放20分钟以后才能采样（即保证排净采样阀管道内残液）。 1.5 样品检验： 细菌总数 1.5.1打开无菌操作台 1.5.2用无菌移液管吸取1ml样品加入90mm的无菌培养皿中； 1.5.3将已冷却至45～50℃PCA培养基15ml倒入装有样品的培养皿中，在操作台上混均； 1.5.4培养基凝固后倒置平放入30℃培养箱中培养4天，检测细菌总数。 大肠菌群 1.5.5将100ml样品进行膜过滤，将0.45um过滤膜置于已倒好麦康凯培养基平板上，保证滤膜与培养基紧密接触。将样品放入37℃培养箱中培养24小时，检测大肠菌群。 1.6 样品结果报告： 1.6.1记录下生长在平板计数琼脂培养皿上生长的微生物总数。如果样品稀释过,那么乘以适当的稀释率。 1.6.2大肠杆菌24小时开始观察并镜检看其是否形成菌落。大肠杆菌在麦康凯培养基会产生深粉色到红色的菌落：革兰氏阳性细菌受到抑制，不会生长。其它的革兰氏阴性品种会形成半透明状，几乎是无色的菌落。 2、冷麦汁、引酒水样采取： 2.1 采样频次：每线每天一次 2.2 检测项目：杂菌总数（WLN） 2.3 采样方法： 2.3.1 取样人员要用含有75％乙醇的棉球对手及前臂进行彻底消毒。 2.3.2在接近冷麦汁进罐的发酵罐入口的管线上，排出采样管线内的残液。用含有75％乙醇的脱脂棉球对取样点及其周围进行初步消毒。 2.3.3使用便携式燃气喷枪，对取样点进行快速火焰灭菌（50秒）。 2.3.4小心开启手动取样阀，使液体流出（10秒）以