十一、哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验.doc

十一、哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验 In Vivo Mammalian Bone Marrow Cell Chromosome Aberration Test 范围 本规范规定了哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验的基本原则、要求和方法。 本规范适用于检测化妆品原料及其产品的遗传毒性。 规范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals （No. 475, April 1997） 试验目的 本试验是一项致突变性试验，检测整体动物骨髓细胞染色体畸变，以评价受试物致突变的可能性。 定义 染色体型畸变(Chromosome-type aberration)：染色体结构损伤，表现为在两个染色单体的相同位点均出现断裂或断裂重组的改变。 染色单体型畸变(Chromatid-type aberration)：染色体结构损伤，表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤。 染色体数目改变(Numerical-fype aberration)：哺乳动物细胞正常染色体数目的改变。 试验基本原则 使哺乳动物（如大鼠或小鼠）经口或其它适宜途径染毒，动物处死前用细胞分裂中期阻断剂处理，处死后制备骨髓细胞染色体标本，分析染色体畸变。 试验方法 6.1 实验动物和饲养环境：选用健康成年大鼠或小鼠，每组每种性别至少5只。 实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。 6.2 受试物 6.2.1 受试物配制：固体受试物应溶解或悬浮于适合的溶剂中，并稀释至一定浓度。液体受试物可直接使用或予以稀释。受试物应在使用前新鲜配制，否则就必须证实贮存不影响其稳定性。 6.2.2 溶剂的选择：溶剂在所选用浓度下，不引起毒性效应，不与受试物发生化学反应。首选为水溶性溶剂。 6.2.3 剂量设置：应进行预试验以选择最高剂量。当有毒性时，可以引起死亡或者抑制骨髓细胞有丝分裂指数（50%以上）为指标确定最高剂量。在第一次采集样品时，需设置3个可供分析的剂量，在第二次采集样品时，则仅需设置最高剂量组。 如果一次剂量为2000mg/kg体重时仍未引起毒性效应，则只设2000mg/kg体重剂量组。 6.3 对照：在每项试验中，对每种性别均应设阴性对照组和阳性对照组。除不使用受试物外，其它处理与受试物组一致。 6.3.1 阴性对照：除设溶剂对照（即仅含溶剂）外，如果没有文献资料或历史性资料证实所用溶剂不具有有害作用或致突变作用，还应设空白对照组。 6.3.2 阳性对照：阳性对照物应能引起染色体结构畸变率明显高于背景资料。染毒途径可以不同于受试物。所选用的阳性对照物最好与受试物类别有关。可以使用下述物质：三亚乙基密胺（triethylenemelamine）、甲磺酸乙酯（ethyl methanesulphonate）、乙基亚硝基脲（ethyl nitrosonrea）、丝裂霉素C（mytomycin C）和环磷酰胺（cyclophosphamide）。 6.4 染毒方式：可采用经口或其它适宜的染毒方式。一般情况下，染毒1次，但分两次采集样品,即每组动物分两个亚组，亚组1于染毒后12h~18h处死并采集第一次样品；亚组2于亚组1处死后24h采集第二次样品。如果采用多次染毒，于末次染毒后12h~18h采集样品。于处死动物采集样品前腹腔注射细胞分裂中期阻断剂（如用秋水仙素，于处死前4h，按4mg/kg体重给药）。 6.5 试验步骤 6.5.1 用颈椎脱臼法处死动物，取出股骨，剔除肌肉等组织。 6.5.2 剪去股骨两端，用注射器吸取5mL生理盐水，从股骨一端注入，用10mL离心管，从股骨另一端接取流出的骨髓细胞悬液。 6.5.3 将细胞悬液以1000r/min的速度离心5 min ~7 min，去除上清液。 6.5.4 加入0.075mol/L KCl溶液7ml，用滴管将细胞轻轻地混匀，放入37℃水浴中低渗处理7min，加入2mL固定液（冰醋酸:甲醇=1:3），混匀，以1000r/min速度离心5 min ~7min，弃去上清液。 6.5.5 加入7mL固定液，混匀，固定7min，以1000r/min的速度离心7min，弃去上清液。 6.5.6 用同法再固定1~2次，弃去上清液。 6.5.7 加入数滴新鲜固定液，混匀。 6.5.8 用混悬液滴片，自然干燥。 6.5.9 用姬姆萨染液染色。 6.6 读片和结果处理 6.6.1 确定有丝分裂指数：包括所有处理组、阳性和阴性对照组（每只动物计数1000个细胞）。 6.6.2 计数畸变细胞：对每只动物选择100个分散良好的中期分裂相，在显微镜油镜下进行读片。在读片时应记录每一观察细胞的染色体数目，对于畸变细胞还应记录显微镜