DNA甲基化修饰对胱硫醚-γ-裂解酶的转录调控和其在动脉粥样硬化发病中的作用研究.pdfVIP

DNA 甲基化修饰对胱硫醚- γ-裂解酶的转录调控及其在动脉粥样硬化发病中的作用研究 中文摘要 中文摘要 目的： 硫化氢 （Hydrogen sulfide, H S）是近年新发现的气体信号分子，参与体内多 2 种病理生理过程，发挥抗炎症和抗动脉粥样硬化等作用。动脉粥样硬化一种慢性 炎症性疾病，单核巨噬细胞介导的炎症反应在动脉粥样硬化形成的全过程都发挥 了重要作用。然而，动脉粥样硬化形成过程中，单核巨噬细胞中H S 及其合成酶 2 胱硫醚- γ-裂解酶（Cystathionine γ-lyase，CSE ）是否以及如何改变，尚未有系统报道。 因此，本论文研究动脉粥样硬化（Atherosclerosis ）发病过程中单核巨噬细胞内CSE- H S 通路的改变及其分子机制。 2 方法： 在体以基因敲除鼠 ApoE-/- 鼠为研究对象，给予高脂饮食饲养建立动脉粥样硬 化动物模型，以 C57BL/6 小鼠予以正常饮食饲养为正常对照组；离体以氧化低密 度脂蛋白（ox-LDL ）作用于巨噬细胞系Raw264.7 。 通过测定小鼠血脂水平和鼠主动脉弓部血管斑块形成评定动脉粥样硬化模型 是否成功；分别采用亚甲蓝化学显色法检测和荧光探针（DNS-Az ）检测细胞外及 血浆硫化氢浓度变化；采用荧光定量PCR （Quantitative polymerase chain reaction, Q-PCR ）检测腹腔巨噬细胞及Raw264.7 细胞胱硫醚- γ-裂解酶（Cystathionine γ -lyase，CSE ）和甲基化转移酶（DNAmethyltransferase ，DNMT ）的转录水平；构 建不同长度的cse 基因启动子荧光素酶报告基因，采用荧光素酶活性检测试剂盒检 测 cse 基因启动子的不同亚片段活性改变；采用甲基化特异性 PCR(methylation-specific PCR,MSP)和亚硫酸盐测序法（bisulfite sequencing PCR ， BSP ）检测基因甲基化改变；采用核蛋白提取试剂盒提取细胞核蛋白，以 DNMT 试剂盒检测DNMTs 活性；合成不同DNMTs 基因的siRNA，运用瞬时转染技术沉 默DNMTs 基因；Western blot 法检测DNMTs 蛋白的表达评价siRNA 的干扰效率。 结果： 与正常小鼠相比，ApoE-/-小鼠血总胆固醇、低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白 水平显著升高（P0.001 ），且随着周龄延长，上述血脂水平逐渐增加；而高密度 I 中文摘要 DNA 甲基化修饰对胱硫醚- γ-裂解酶的转录调控及其在动脉粥样硬化发病中的作用研究 脂蛋白水平较正常小鼠显著降低（P0.001 ），但不同周龄鼠之间，高密度脂蛋白 水平无显著差异。取小鼠主动脉弓进行石蜡切片，苏木精—伊红染色可见16 周与 20 周龄的ApoE-/- 鼠主动脉弓部有明显粥样斑块形成，8 周与12 周龄以及正常鼠未 见斑块形成。血浆硫化氢检测结果显示不同周龄正常对照组小鼠硫化氢水平无明 显改变，而ApoE-/-小鼠血浆H S 水平随着周龄的增加逐渐下降（P0.001 ）, 与对 2 照组相比有统计学差异；定量 PCR 结果显示各周龄的基因敲除鼠腹腔巨噬细胞 CSE mRNA 水平较对应周龄的C57BL/6 鼠显著下降（P0.001 ）；随着周龄的增加， ApoE-/- 鼠巨噬细胞CSE mRNA 水平逐渐增加，于 12 周达高峰，后逐渐下降，而 不同周龄正常小鼠之间CSE mRNA 无明显差异。另外，20 周龄的ApoE-/- 鼠腹腔 巨噬细胞甲基化转移酶mRNA 水平较正常对照组水平显著升高（P0.05 ）。 亚基蓝法检测胞外硫化氢显示 ox-LDL 致raw264.7