即同目的基因变性dna互补彼此杂交的mrna.pptVIP

一 DNA的体外重组（切与接） 外源DNA片段同载体分子连接的方法，即DNA分子体外重组技术，主要是依赖于核酸内切限制酶和DNA连接酶的作用。 一般说来在选择外源DNA同载体分子连接反应程序时，需要考虑到下列三个因素： (1) 实验步骤要尽可能地简单易行， (2) 连接形成的“接点”序列，应能被一定的核酸内切限制酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段， (3) 对转录和转译过程中密码结构的阅读不发生干扰。? 二 用于基因转移的受体菌或细胞 A 受体细胞应具备的条件 一、宿主的选择 从安全性考试，应具备以下条件： 1. 不适合在人体内生存 2. 不适合在非培养条件下生存 3. 在非培养条件下，其DNA容易解体 4. 它的DNA不易转移 5. 它的质粒只在这一宿主由复制 6. 便于检测 A 受体细胞应具备的条件 从遗传性考虑： 1.重组缺陷型recA－，用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-） 2.限制系统的缺陷，或是修饰系统的缺陷。避免对外源DNA的除解。外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-） 3.与重组质粒的遗传性状要有显的差异（具有与载体选择标记互补的表型） 4. 具有较高的转化效率 三 重组DNA分子的转化和扩增（转与增） 四 转化子的筛选和鉴定（检） 四 转化子的筛选和鉴定（检） 胸腺嘧啶核苷激酶简称胸苷激酶（thymidine Kinase,TK）在所有真核细胞中都有表达, 是嘧啶生物合成补救代谢途径中的一个关键酶, 它可催化胸苷磷酸化转变成为dTMP, 继续磷酸化生成dTTP, 参与DNA的生物合成。 在模板指导下，聚合酶不断将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP）,由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA的核苷酸序列。 双脱氧终止法测序反应体系包括： DNA聚合酶 单链DNA模板 带有3-OH末端的单链寡核苷酸引物 Mg2+ 4种dNTP(aATP,dGTP,dCTP和dTTP) 4种ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP) Sanger法DNA测序的试剂 ① 引物：通常由20-23个碱基构成，G+C=12，A+T=8到11，Tm=60-68℃，避免形成引物二聚体或形成发卡样结构 ② 模板 ③ DNA聚合酶 ④ 2′，3 ′-双脱氧核苷三磷酸 （ 2′, 3 ′-dideoxynucleoside triphosphate, ddNTP ） ⑤ dNTP B克隆DNA序列检测 菌落噬菌斑原位杂交法 杂交探针的标记：DNA聚合酶介导的缺刻前移标记 5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5‘ Mg2+ 5‘ dNTP 5‘ ppp dA（a-32P-dATP） 5‘ … G-C-T-C A-G-C-T-G-G A-G-T… 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5‘ 5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5‘ DNase I DNA pol I B克隆DNA序列检测 菌落噬菌斑原位杂交法 杂交探针的标记：ABC荧光标记 GCTTGAGCAGTAACCTG 荧光胺 Biotin 生物素 Avidin 生物素结合蛋白 烷烃连接臂 B克隆DNA序列检测 菌落噬菌斑原位杂交法 杂交探针的标记：ABC显色酶标记 GCTTGAGCAGTAACCTG 显色酶 Biotin 生物素 Avidin 生物素结合蛋白 烷烃连接臂 生色底物 颜色产物 B克隆DNA序列检测 菌落噬菌斑原位杂交法 杂交探针的标记：地高辛系统标记 dUTP-连接臂-甾醇半抗原 digoxigenin DIG 抗体-显色酶交联复合物 B克隆DNA序列检测 DNA序列分析法 双脱氧末端终止测序法的基本原理： DNA序列测定是精确鉴定目的基因的重要手段，目前国际上流行采用Sanger发明的双脱氧末端终止法测定DNA序列，其工作原理是在DNA聚合反应的进程中，通过位点特异性终止测定DNA序列其关键技术有： DNA链聚合反应时的定点随机中断（ddNTP） 聚丙烯酰胺凝胶电泳的