发生免疫反应的性能抗原分类.pptVIP

4. 竞争ELISA 竞争法测抗体 ：待测抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。 竞争法测抗原 ：待测抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合，结果如待测抗原含量越多，与固相抗体结合的酶标抗原就越少，显色越浅，二者呈负相关。 ELISA竞争法示意图（测抗原） 抗原与抗体反应 加抗原抗体复合物 至抗原包被载体 加酶标抗抗体 洗涤 加底物显色 洗涤 5. 单位点非竞争ELISA 基本原理：将待测半抗原与适度过量固相抗体作用，洗涤后加入已知量的过量酶标半抗原，去除未结合的酶标半抗原，经显色测定，酶活性（颜色深浅）同标准或被测半抗原的浓度成反比。 固相抗体 加半抗原 洗涤 加酶标抗体 洗涤 加底物和显色 测定 半抗原 酶 底物 本法主要用于半抗原（药物、多肽、激素等）测定。 三 、放大ELISA技术 生物素-亲和素系统 酶放大系统 使用荧光底物 （一）、 生物素-酶标亲和素系统（BAS-ELISA） 基本原理：通过生物素标记抗体连接免疫反应系统，借助生物素化酶或酶标亲和素引入酶与底物反应系统。 BAS-ELISA可用来检测多种抗原抗体系统如细菌、病毒、肿瘤细胞表面抗原等。 1. 基本概念 生物素（biotin，B）：又辅酶R或维生素H，是在动植物中广泛分布的一种生长因子，以辅酶形式参与各种羧化酶反应。其分子量244.31，咪唑酮环是亲合素结合的主要部位，噻唑环侧链戊酸末端羧基是抗体和其他生物大分子结合的唯一结构。 亲和素（avidin，A）：又抗生物素蛋白、卵白素或亲和素，是从卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，分子量68kDa。亲合素由4个相同的亚基组成，能结合4个分子的生物素。 链霉亲和素 (streptavidin，SA) ：是链霉菌在培养过程中分泌的一种稍偏酸性的蛋白质产物，分子量 65KDa。 2. 基本原理 生物素-亲和素系统 (BAS)系统免疫技术：利用亲和素对生物素高亲和力，以及生物素和亲和素可修饰性的特点，并与荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合；同时由于生物素结合亲和素的多价性，产生多级放大效应，使各种示踪免疫分析的特异性和灵敏度进一步提高。 生物素-亲和素系统ELISA (BAS-ELISA) ：是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素(B)与亲和素(A)间的高度放大作用建立的一种检测系统。 生物素－酶标亲和素系统原理图 亲和素 过氧化物酶 生物素 标记蛋白质氨基 生物素N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）、 长臂BNHS、生物素对硝基酚酯 标记蛋白质醛基 肼化生物素(BCHZ) 、赖氨酸生物素酰肼 标记蛋白质巯基 赖氨酸生物素-丙氨-N-顺丁烯二酰亚胺 标记蛋白质糖基 生物素酰肼（BHZ） 标记蛋白质的活化生物素 3. BAS-ELISA分析模式 方法 模式 反应原理 直接法 BAB 固相Ab-Ag-(Ab-B)-A-B-E BA 固相Ab-Ag-(Ab-B)-A-E ABC 固相Ab-Ag-(Ab-B)-ABC-E 间接法 BAB 固相Ab-Ag-Ab1-(Ab2-B)-A-B-E BA 固相Ab-Ag-Ab1(Ab2-B)-A-E ABC 固相Ab-Ag-Ab1(Ab2-B)-ABC-E 3.1 桥联亲和素-生物素法(BRAB) 基本原理：抗原与生物素化的抗体结合后，通过游离亲合素将生物素化的抗体与酶标生物素搭桥连接，达到多层放大效果，又称BAB法。 固相 抗体 抗原 生物素 化二抗 亲和素 生物素化酶 显色 3.2 标记亲合素－生物素（LAB）法 基本原理：生物素化抗体与抗原结合后，继而跟酶标亲合素结合，如此提高了检测抗原的敏感性。 固相 抗体 抗原 生物素 化二抗 酶标亲和素 显色 3.3 亲合素-生物素-过氧化物酶复合物法（ABC法） 基本原理：将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，待检抗原先后与一抗、生物素化二抗、ABC复合物结合，形成晶格样结构的复合体，其中网络了大量酶分子，从而大大提高检测抗原的灵敏度。 固相 抗体 抗原 生物素 化二抗 亲合素－生物素－ 过氧化物酶复合物 显色 BAS-ELISA注意事项 反应物的浓度及比例：增加抗体浓度可使敏感性提高，但过大又可使非特异性随之增大。 生物素的稳定性：生物素标记抗体加等量60％甘油于-20℃可保存2年左右。保存时切忌反复冻融。 亲和素的稳定性：亲和素在某些金属离子存在下对光敏感，容易失活。 亲和素的非特异性吸附：亲和素在PH中性环境中是带正电荷的，可通过静电作用非特异性地吸附到固相载体上。 第三章 免疫分析 zhaohu@