miR-146a在脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤中的作用和机制研究.pdfVIP

研究背景和目的 急性肺损伤(Acute LungInjury，ALl)／急性呼吸窘迫综合征(Acute Distress Respiratory Syndrome，ARDS)指由心源性以外的各种肺内外致病因素 导致的肺部炎性反应，使肺泡．毛细血管上皮细胞及肺部屏障结构受损，肺气体 交换功能发生障碍，是一种以急性、进行性、顽固性低氧血症为特征的临床综 合征，是目前导致危重病人死亡的主要原因。尽管不断出现新的治疗ALI／ARDS 的方法，包括肺保护性通气策略、体外膜肺氧合、高容量血液滤过等，但其死 亡率依然高达30％～50％。在ALI／ARDS发生发展过程中，肺泡巨噬细胞介导的 固有免疫反应发挥着关键作用。当肺组织受到肺内外各种因素刺激时，可以活 化肺泡巨噬细胞膜上的Toll受体(Toll．1ike receptors，TLRs)，再经信号蛋白的 转导活化核转录因子．KappaB(nuclearfactor．KappaB，NF．1cB)，诱导大量炎症 因子的表达释放，促使炎症反应的级联放大，形成肺内炎症“瀑布”反应，导 致ALI／ARDS的发生。因此，抑制肺泡巨噬细胞过度活化、降低肺内炎症反应 调控中具有重要作用，它通过靶向沉默TLRs／NF．r．B信号通路中的两个关键信号 转导蛋白，能够阻断NF．1(B活化，从而抑制炎症因子的释放，有望成为抑制肺 泡巨噬细胞过度活化，降低肺内炎症反应的有效措施。本实验首先通过体外构 建肺泡巨噬细胞炎症反应模型，观察miR-146a和炎症因子的表达变化，分析 miR一146a在肺泡巨噬细胞炎症反应中的调控作用，然后经体外转染miR一146a 信号通路关键蛋白表达的影响，分析它在肺泡巨噬细胞炎症反应中的调控机制， 最后于体内构建大鼠ALl模型，观察miR一146a在肺损伤组织中的表达变化，并 结合体外研究结果，探讨其在大鼠ALl模型中的调控作用及作用机制，为临床 治疗ALI提供新的治疗思路。 研究内容和方法： 1体外实验 (1)将体外培养的大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383)按2×106个／孔接种于六孔 塑茎 —————————————————————-——————————————————_——————————————————————一——一 LPS处理细胞，于刺激Oh、3h、6h、 板，细胞贴壁90min，加入终浓度llag／ml 12h的各个时间点收集细胞和细胞上清液。用实时荧光定量PCR(RT—qPCR)分 一—一 (ELISA)检测细胞培养上清液中TNF一值蛋白的表达变化； (2)将体外培养的NR8383细胞按1．5×106个／孔接种于六孔板，细胞贴壁 mimic转染NR8383细胞24h后收集细胞。 90min，加入50nM浓度的miR．146a IRAK．1 mRNA和TRAF．6mRNA的表达变化，用Westernblot检测细胞内 的靶基因； (3)将体外培养的NR8383细胞按1．5×106个／孔接种于六孔板，细胞贴壁 90min，加入50nM浓度的miR-146a mimic转染NR8383细胞24h，再加入终浓 度199／ml LPS处理细胞6h后收集细胞和细胞上清液。用RT．qPCR检测细胞中 TNF-0c 蛋白的表达变化，用免疫荧光及Western blot检测细胞内NF．1CB p65的核移位变 化，明确miR一146a对炎症反应的调控作用及作用机制。 2体内实验 选择雄性SPF级8～10周龄SD大鼠，按7．5mg／kg的脂多糖，经气道滴入大 鼠肺部诱导ALI模型，造模6小时后处死大鼠，检测肺损伤程度。留取右肺行 检测肺组织中miR一146a以及TNF．G