MiRNA在肝癌干细胞及肝癌细胞中差异表达谱的研究.pdfVIP

2 目 录 1 MiRNA 在肝癌干细胞和肝癌细胞中差异表达谱的研究…………1 1.1 中文摘要 ………………………………………………………1 1.2 英文摘要………………………………………………………4 1.3 前言……………………………………………………………8 1.4 肝癌干细胞的富集与鉴定……………………………………11 1.4.1 材料与方法…………………………………………………11 1.4.2 结果…………………………………………………………17 1.4.3 讨论…………………………………………………………25 1.5 miRNA差异表达谱的研究……………………………………29 1.5.1 材料与方法…………………………………………………29 1.5.2 结果…………………………………………………………35 1.5.3 讨论…………………………………………………………40 1.6 全文小结………………………………………………………44 1.7 参考文献………………………………………………………45 1.8 英汉缩略词对照表……………………………………………54 2 致谢………………………………………………………………56 3 MiRNA 在原发性肝癌中研究进展（综述）……………………58 1 2 摘 要 研究背景与目的： 肿瘤干细胞学说认为肿瘤中存在一群数量极少，具有自我更 新和分化能力的肿瘤细胞，即肿瘤干细胞 (Cancerstem cell，CSC)。 目前研究发现，肿瘤干细胞是维持肿瘤生长、转移和复发的根源， 消灭肿瘤干细胞可能成为治愈肿瘤、防止复发的新方向。同时,研 究发现一些mircoRNA(miRNA)的异常表达导致了肿瘤的发生、发展， 并广泛参与了肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡、侵袭和转移的调节。 本实验旨在探讨通过非粘附球培养法从肝癌细胞系中富集肝癌干 细胞，利用基因芯片技术筛查肿瘤细胞和肿瘤干细胞的 miRNA 表达 谱，分析两者表达谱的差异，为进一步探讨 miRNA 在肝癌干细胞分 化中的作用和调控机制提供新的线索。 方法： 1、应用非粘附球培养法从肝癌细胞系中富集到肝癌干细胞样细胞 球，并进行体外扩增。利用肿瘤干细胞的一些特性对富集到的肝癌 干细胞样细胞球进行鉴定。 2、将通过鉴定的肝癌干细胞提取总 RNA。利用紫外分光光度计和 琼脂糖凝胶电泳技术对提取的 RNA 进行质量检测。对符芯片要求的 RNA 进行荧光标记再与 Exiqon miRNA 基因表达谱芯片进行杂交。 然后用扫描得到的芯片结果进行 miRNA 表达差异分析。 1 结果： 1、利用非粘附球培养法可以在Hep3B、 HepG2、 Huh7 细胞系中富 集得到悬浮成球生长的细胞球且都能持续传代。且单细胞成球实验 证实悬浮细胞球是由单个细胞增殖形成，不是多个细胞聚集。 2、富集得到的 Huh7 悬浮细胞球细胞体外形成的集落数是 Huh7 细 胞二倍。说明细胞球细胞体外集落形成能力较 Huh7 细胞强。 3、Huh7 细胞被甲苯胺蓝染成蓝紫色，而 Huh7 悬浮细胞球细胞不 能被染色，说明干细胞培养条件下的肿瘤细胞球的细胞通透性降 低。 4、流式检测Huh7 悬浮细胞球细胞的干细胞标志分子 CD326 为 93%， 肿瘤细胞的 CD326 为 0.2%，表明在Huh7 悬浮细胞球细胞的干细胞 特异性分子表达明显上调。 5、裸鼠成瘤实验显示 5000 个 Huh7 悬浮细胞球细胞细胞就能使裸 鼠成瘤，而huh7 最少需要 10 万个才能成瘤。说明 Huh7 悬浮细胞 球细胞的成瘤性远远大于普通肿瘤细胞。 6、分别取Huh7 细胞和第 3 代的 Huh7 悬浮细胞球细胞用 Trizol 法 提取总 RNA，并用紫外分光光度计测得 OD28