碳酸酐酶Ⅲ的磷酸酶活性关于证及神经支配和肌肉活动对碳酸酐酶Ⅲ的影响.pdfVIP

复旦文学硕士论文 碳酸酐酶lII的磷酸酶活性论证及神经支配和肌肉活动对碳酸酐酶IIl的影响 摘要 gravis，MG)是一种神经．肌肉接头传递障碍的疾 重症肌无力(myasthenia 病，多数患者血清中存在抗神经．肌肉接头突触后膜乙酰胆碱受体(AChR)的 自身抗体。长久以来，相关自身抗体诱导的自身免疫损伤被认为是MG的主要 发病机制；这种认识的合理性和指导意义已在多年临床诊治实践中被反复地论 证。然而，要追溯患者自身免疫的源头，或试图阐述不同个体(如有些患者血 清乙酰胆碱受体自身抗体阴性，有些患者血清中有多种自身抗体的存在等)的 病理生理机制，或要解释首发病灶的相对选择性，以及寻求解释MG患者受累 肌肉的易疲劳性，很难用自身免疫损伤理论进行合理的充分阐述。是不是还存 在其他的病理改变被忽略导致了上述的困惑?就现有的认识而言，MG骨骼肌 是受累部位及各种免疫损伤作用的靶点，骨骼肌的各种结构蛋白质和功能蛋白 质是它发挥和执行各种生理功能的物质基础。因此，了解MG骨骼肌蛋白质的 变化进而筛选鉴定与MG相关的蛋白质(疾病相关蛋白)，这无论对加深MG 病理生理机制的认识还是作为对现有自身免疫损伤理论的补充都有十分重要 的意义。在以前的研究中，我们发现了MG患者骨骼肌中的碳酸酐酶III (Carbonic III，EC anhydrase 于其他非MG肌病患者及正常个体。 由于骨骼肌CAIII蛋白水平的下降必定伴随其功能的下调，因此，为进一 步探讨CAIII与MG的关系，CAIII生理功能的了解就至关重要。然而，目前 对CAIII的生理功能还没有明确的认识，对它在不同的病理状况下发生的改变 和改变的意义更是知之甚少。已有研究发现CAIII具有磷酸酶的活性，并认为 CAIII可能涉及了细胞的信号传导、氧化应激、和凋亡等。不幸的是，目前对 CAIII的磷酸酶活性存有争议，有研究指出CAIII并不具有内在的磷酸酶活性， 而是在分离纯化过程中有一个污染的蛋白磷酸酶成分所致。从以往本课题一系 列的研究结果我们曾推测：CAIII缺乏可能与MG骨骼肌的易疲劳和收缩无力 有关。如若CAIII具有磷酸酶功能，势必对上述的推测甚至对MG的病理机制 认识具有极大的启迪与帮助，因此，论证CAIII究竟是否具有内在的磷酸酶活 性对进一步了解MG十分关键。 同时目前的观点认为，MG骨骼肌的活动无力和易疲劳性是神经．肌肉接头 处神经冲动传递受阻所导致。基于骨骼肌的特性同时受神经支配和自身活动 4 复旦文学硕士论文 (活动依赖性和活动非依赖性)因素的共同调控，那么MG患者骨骼肌中的 CAIII减少是否与神经冲动传导受阻或其所致的骨骼肌活动减少有关呢?阐明 此问题势必有助于认识骨骼肌CAIII表达减少与MG的关系以及这种改变对疾 病的意义。 第一部分碳酸酐酶lIl磷酸酶活性的论证 目的：探讨碳酸酐酶IIICAIII是否本身具有磷酸酶活性。方法：采用双 向电泳结合WesternBlot方法将分离的骨骼肌蛋白转移至硝酸纤维膜，利用镜 像原理，识别与CAIII抗体发生免疫反应的抗原在双向电泳图谱中的确切位置。 在此基础上，以同样的方法与原理对转移至固相膜上的骨骼肌蛋白进行磷酸酶 活性原位染色，观察CAIII是否染色。此外，通过磷酸酶抑制剂实验及酶催化 反应动力学实验，论证CAIII的磷酸酶活性染色特异性及CAIII的磷酸酶催化 功能。结果：CAIII抗体反应显示，利用镜像原理能从复杂的双向电泳图谱中 容易地识别CAIII蛋白；磷酸酶活性染色表明，鉴定的CAIII具有磷酸酶活性。 磷酸酶特异抑制剂实验表明，CAIII的磷酸酶活性染色具有特异性；酶催化反 应动力学研究证实，CAIII蛋白具有确凿的磷酸酶功能。结论：骨骼肌的CAIII 本身具有磷酸酶活性，可能参与细胞的磷酸化．去磷酸化过程。这提示MG时 可能涉及了骨骼肌细胞氧化应激改变或细胞信号转导缺陷等。 第二部分去神经对碳酸酐酶111表达和磷酸酶活性的影响 目的：探讨神经冲动对CAIII表达和磷酸酶活性的影响。方法：定向切断 支配大