鸭瘟病毒US2蛋白特性分析及小RNA干扰对US2基因功能影响初探.pdfVIP

121413 JO 中文摘要 关于鸭瘟病毒(Duck Virus，DPV) Plague US2基因的研究很少，本论文将本 实验注册的DPV．CHv株US2基因(GenBank 息学分析，开展原核表达、US2蛋白纯化、兔抗蛋白抗体的制备等，然后分别通过实 时荧光定量PCR和WesternBlot来检测US2基因在DPV感染鸭胚成纤维细胞过程中 转录水平的变化以及表达动力学过程。为了更清晰地揭示US2蛋白在细胞中的动态 过程，我们采用了间接荧光免疫方法来检测US2的定位，同时通过病毒蛋白酶K实 验鉴定了US2蛋白属性。为了验证US2基因是否有抗原递呈功能，用小RNA干扰 载体来干扰US2基因的功能，然后用MHCELISA试剂盒来检测US2基因干扰前后 的MHC水平的变化。 1．鸭瘟病毒US2基因的克隆、原核表达以及多抗的制备对鸭瘟病毒US2基因进行 序列分析、克隆及原核表达，并利用获得的His重组蛋白分别制备了兔抗US2．IgG多 克隆抗体，抗体琼扩效价为1：16。 mRNA 细胞定位分析采用实时荧光定量PCR技术对DPV感染DEF不同时期US2 的水平变化进行荧光定量分析；并提取不同感染时期细胞蛋白，利用蛋白免疫印迹法 24h 检测US2蛋白在DEF中的表达水平变化。荧光定量结果表明：DPV感染DEF 至72h，US2基因转录水平持续上升，84h至96hUS2mRNA含量急剧下降，与对照 组的转录水平相比，有明显差异。免疫印迹结果表明，DEF感染DPV从48h开始能 集中在细胞膜上，而且越来越多；从60h开始集中在细胞质和细胞核周围，到了84h 时，蛋白在细胞质中明显增多。 表达量有所减少针对US2ORF的不同靶区，我们设计并合成4个shRNA载体以确 保靶基因被有效抑制。目的是筛选出有效的干扰shRNA来干扰DPVUS2基因转录， 为研究DPVUS2基因的功能提供基础。用荧光定量技术筛选出能有效干扰US2基因 转录的RNA载体，然后干扰US2转录表达，用MHCELISA试剂盒检测到DEF细 胞表面上的MHC的表达量有显著增加，该实验可以推断DPVUS2基因对DEF细胞 表面的MHC抗原递呈分子的表达有抑制作用。 4．用浓缩纯化的病毒颗粒进行病毒蛋白酶K实验证实了US2蛋白是皮层蛋白研究 鸭瘟病毒US2基因表达产物是否属于结构蛋白，属于哪种结构蛋白，对探索其基因 编码蛋白的功能、病毒的转染、出芽、释放等具有重要的意义。目前文献中提到US2 蛋白在疱疹病毒中属于外膜或者皮层蛋白，但是对DPV的US2蛋白是哪种蛋白并没 有作探究。该实验利用高浓度蔗糖溶液来浓缩病毒粒子，然后分别用去垢剂SDS和 蛋白酶K分别来溶解DPV的外膜脂溶性蛋白和其他蛋白成分，同时用已经明确是皮 万方数据 层蛋白的UL51蛋白作为对照，实验结果证明了US2蛋白在DPV中是一种皮层蛋白。 Yetis7：鸭瘟病毒；US2基因；克隆表达；转录表达；小RNA干扰；皮层蛋白 万方数据 ABSTRACT shRNAand functionofDPVUS2 inhibited Study gene by characterizationofUS2 protein Jie