ELISA精密度及评价.docVIP

实验设计 ELISA检测AFP试验精密度的评价 原理： 采用双抗体夹心一步法：用纯化的甲胎蛋白（AFP）抗体包被微孔板，制成固相抗体，在向微孔中同时加入AFP与酶标抗体，经过一次温育，然后彻底洗涤，加入底物TMB并避光显色，TMB底物经HRP催化反应为蓝色物质，使溶液呈现蓝色，加入强酸（H2SO4）终止剂后，溶液呈黄色，其颜色（黄色）的深浅与AFP浓度呈正相关。 用酶标仪在主波长为450nm，次波长为630nm下，10min内测定各孔吸光度A。ELISA的精密度可用其反义概念不精密度来表示，不精密度可用标准差（S）和变异系数（CV）反映： 仪器和试剂： 试剂：高浓度的（400ng/ml）AFP血清1.5ml，低浓度（20ng/ml）AFP血清1.5ml，蒸馏水，（AFP）ELISA试剂盒(酶联板、HRP标记的抗AFP抗体、AFP阴性对照试剂、AFP阳性对照试剂、TMB显色液、浓缩洗涤液、终止液、封板膜)。 仪器：酶标仪、微量加样枪及配套吸管、刻度吸管（2ml）、恒温水浴箱、洗板机、吸水纸、消毒缸、剪刀、洗瓶、记号笔、洗耳球。 试验方法： 1、微孔编号：阳性对照孔：A1、A2，阴性对照孔：A3、A4、A5和空白孔A6，高浓 度血清加样孔为：A7-C2，稀释血清稀释液加样孔为：C3-D10。 2、加样：向阳性对照孔、阴性对照孔分别加入阳性对照试剂、阴性对照试剂各50ul， 空白孔不加任何试剂，向A7-C2中各加入高浓度血清各50ul、向C3-D10加入低浓 度血清液各加入50ul，并向每孔中加入酶标AFP抗体50ul，空白孔不加，轻轻震荡 混匀。 4、温育：用封板膜进行封板，将微孔板置于37℃恒温水箱温育30min. 5、洗涤液的稀释：将浓缩洗涤液用蒸馏水进行20倍稀释后备用。 6、 洗涤：取出微孔板，揭去封板膜弃去液体，向每孔中加满稀释洗涤液然后浸泡30-60s， 弃去洗涤液，如此重复5次后拍干。 7、显色：每孔中依次加入显色剂A、显色剂B 各50ul，室温避光显色5min。 8、比色测定：每孔中加入终止液50ul，轻轻震荡混匀，在阴性对照孔为无色，阳性对 照孔为黄色，空白孔为无色的情况下，设定酶标仪主波长为450nm、次波长为630nm 对每孔进行吸光度A的测定，并进行记录。 吸光度值 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D 结果判断： 阴阳性对照孔可用，则阳性为黄色，空白对照孔、阴性为无色，样品孔呈黄色。此 时可利用样品孔对ELISA进行精密度的评价。 实验结果计算和统计学处理： 分别计算出平均值、标准差和变异系数并进行精密度的评价。 质量控制： 1、实验必须设置阴阳性对照和空白对照从而保证实验的可信性和质量。 2、试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后 如未用完，板条应装入密封袋中保存。