酵母基因克隆及表达载体.docVIP

酵母基因克隆及表达载体 二.酵母基因克隆和表达载体 (一).功能型骨架载体-----用于不同用途的功能研究和载体改造 1、酵母基因组整合质粒(Yeast integrating plasmid, YIP) (1).Trp筛选标志 (2).Ura筛选标志 (3).Leu筛选标志 (4).His筛选标志 (5).G418筛选标志 此类质粒经酶切线性化后可整合到酵母细胞基因组中 用途: a.基因取代或基因删除 b.稳定型表达元件的整合(integration)和敲入(knock in) 2、酵母中心粒-自主复制质粒(Yeast CEN-ARS plasmid, YCP) (1).Trp筛选标志 (2).Ura筛选标志 (3).Leu筛选标志 (4).His筛选标志 (5).G418筛选标志 此类质粒在细胞内可自主复制,且由于含有中心粒复制序列,因此每个细胞近乎只有一个拷贝。 用途: 由于每个细胞平均只有一个拷贝,避免了目的基因的盈余表达,因而特别适用于基因功能的研究 3、酵母附加体质粒(Yeast episomal plasmid, YEP) (1).Trp筛选标志 (2).Ura筛选标志 (3).Leu筛选标志 (4).His筛选标志 (5).G418筛选标志 此类质粒在细胞内以附加体的形式高度复制, 每个细胞高达200-400个拷贝贝 用途: 用于外源基因的表达 (二). 表达载体 1、GAL1启动子表达载体-----半乳糖诱导的表达载体 (1).Trp筛选标志 (2).Ura筛选标志 (3).Leu筛选标志 (4).His筛选标志 (5).G418筛选标志 2、Cup1启动子表达载体-----硫酸铜诱导的表达载体 (1).Trp筛选标志 (2).Ura筛选标志 (3).Leu筛选标志 (4).His筛选标志 (5).G418筛选标志 3、ADH启动子表达载体-ADC1组成型表达载体 (1).Trp筛选标志 (2).Ura筛选标志 (3).Leu筛选标志 (4).His筛选标志 (5).G418筛选标志 神奇的酵母遗传学技术和高等生物基因功能研究讲座（一）外源基因在酵母中的表达 2010-07-24 11:51:11| 分类： 酵母遗传学方法和 | 标签：酵母培养基 选择缺陷 dropout 表达质粒 |举报|字号 订阅 作者：泛基诺技术部模式生物组 朱蕾诺 芽生酵母（budding yeast, Saccharomyces cerevisiae）俗称酿酒酵母,是单细胞真核生物，它的基因组比较简单（仅为大肠杆菌的3-4倍），易于操作，遗传背景相对清楚，加之其突变株又易于分离，而被誉为“真核大肠杆菌”（Eukaryotic E.coli）和“体内试管”（In vivo test tube), 因而是研究高等真核生物基因功能的理想模式生物。正象离不开大肠杆菌的操作一样, 一个向深度发展的分子生物学实验室离不开酵母实验操作。 作为分子生物学实验操作的案头资料-红皮书(Current Protocol in Molecular Biology)将酵母作为一个独立的章节和其他常用分子生物学实验技术并行而列；而被生命科学实验室奉为圣经的分子克隆, 其第三版的多个章节则穿插有不同方面的酵母实验操作, 足见酵母遗传学方法在当今生命科学研究中的重要作用。酵母在生命科学研究中主要用于以下几个方面: 一、外源基因在酵母中的的表达(Foreign gene expression in yeast) 最常用的外源基因表达受体是大肠杆菌，然而，自然界一些物种之间存在巨大的密码子偏好差异，一些物种的基因可以在大肠杆菌中得到有效的表达，而另一些物种的基因则在大肠杆菌中表达很弱或不能表达（如某些林木类植物），在这种情况下，作为真核细胞的酵母便成为目的基因表达的首选受体细胞。泛基诺公司技术部成功地为一些林业科学研究单位表达出大量具有天然活性的蛋白质，而这些蛋白质在原核生物大肠杆菌中是不能表达的（更详细的理论和技术信息可发电子邮件到:fungenome@126.com进行咨询）。另外，由于酵母具有易于繁殖且又无毒的特性（日常生活中用来发酵面粉和酿酒，故又称为面包酵母和啤酒酵母），因此生物技术和产业界研究人员常用酵母来表达外源基因，获得大量具有天然活性的蛋白质和经基因工程改造生产疫苗等。 1． 酵母表达载体的选择 用酵母来获得高产量蛋白质，其表达载体应具备以下三个特点：一是高效启动子，二是高拷贝质粒，三是可控性。GAL1启动子在半乳糖的诱导下，具有高效启动表达的特性，且在葡萄糖存在的情况下表达几乎完全被抑止，因此在大量表达某些蛋白可能对酵母细胞产生毒性的情况下，GAL1诱导性启动子是很好的选择。这类表达载体的代