红曲菌氨肽酶产酶条件优化.docVIP

红曲菌氨肽酶产酶条件优化 　摘　要：通过单因子筛选试验和正交试验对红曲菌产氨肽酶的液体发酵培养基进行优化，结果表明：最佳液体发酵培养基组成为：90.0g/L蛋白胨、25g/L可溶性淀粉、0.5g/L硫酸镁。稳定性试验验证证明，以最佳培养基发酵，氨肽酶酶活力高，平均酶活力为376.9 U/mL。 关键词：红曲菌； 氨肽酶； 酶活力 1前言 红曲菌通过液体发酵和固体发酵，能产生多种生物活性酶以及生理活性物质：Monacolin-K、麦角固醇、γ-氨基丁酸、天然植物激素、淀粉酶、麦芽糖酶、蛋白酶、果胶酶、葡萄糖淀粉酶、糖化酶、脂肪酶、酯化酶等[1]。刘芳教授自1999年起在日本安田教授的指导下开始了红曲菌羧肽酶的研究, 从28种红曲菌菌株进行了羧肽酶高产菌株的筛选，培养物通过科学合理的分离纯化步骤进行了羧肽酶的分离纯化，经过理化特性和酶学特性的初步研究，表明得到了3种不同的红曲菌羧肽酶，除其中1种和曾经报道过的其他真菌羧肽酶可能相同以外，而另外2种则可能是不同于其他的两种新型的真菌羧肽酶，并且得到了红曲菌羧肽酶的少量纯品[2,3,4]。根据肽酶作用部位不同，可分为氨肽酶（作用于有游离氨基端的肽键）；羧肽酶（作用于有游离羧基端的肽键）。氨肽酶（aminopeptidase）一种蛋白酶，属于肽链端解酶，可使氨基酸从多肽链的N-末端顺序逐个地游离出来。在蛋白水解液脱苦和蛋白质的深度水解中有重要作用。产氨肽酶的微生物的种类很多，细菌、酵母、霉菌中通常都含有一定量的氨肽酶。但各种微生物中氨肽酶的含量和种类有很大的差异。米曲霉至少能产生7种氨肽酶[5]。 在国内氨肽酶生产及应用方面的研究，处于起步的阶段，实现氨肽酶的规模生产还有一段很长的路。实现氨肽酶的国产化，可以提高我国相关产业的加工水平，降低成本，增强行业竞争力，打破这种垄断的局面有着重要的意义。本文是研究红曲菌氨肽酶产酶条件的优化，为以后的进一步研究提供一个参考。 2材料和方法 2.1实验原料及试剂 紫色红曲菌 购于中国普通微生物菌种保藏管理中心、L-亮氨酸-4-硝基苯胺 购于阿拉丁试剂网、马铃薯，葡萄糖，琼脂，磷酸二氢钠、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、乳糖、KH2PO4 、NaHPO4、CaCl2、MgSO4·7H2O、FeSO4、 硝酸钠、乳酸 2.2实验设备及器材 FA1104型分析天平，上海方瑞仪器公司、 722分光光度计，上海第三分析仪器厂、电热恒温水浴锅，上海医疗器械五厂 2.3 实验方法 2.3.1 培养基的制备 1) 活化培养基(g/L)：马铃薯200，琼脂18，葡萄糖20，pH值7.2～7.4。2) 种子培养基(g/L): 葡萄糖50,蛋白胨15,NaNO3 2,KH2PO4 1.5,MgSO4·7H2O 1, pH值5.5。3) 基础产酶培养基(g/L):葡萄糖50,蛋白胨20, pH值5.5。 以上培养基pH用乳酸调配, 0.1MPa、121.3℃湿热灭菌20min。 2.3.2 菌株培养 1) 试管斜面活化培养:接种满环于马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基, 30℃恒温培养5～7 d；2) 孢子悬浮液制备:活化菌种用10 mL无菌水洗入已灭菌装有玻璃珠的三角瓶中,制成1×106个·mL-1的孢子悬浮液；3) 种子摇瓶培养: 接种5mL孢子悬浮液于装有50 mL的种子发酵培养基的250 mL三角瓶中,置于32℃、160 r·min-1恒温摇床培养36～48 h；4) 液体摇瓶培养:接种5 mL种子液于装有50 mL基础产酶培养基的250 mL三角瓶中,置于32℃、160 r·min-1恒温摇床培养72 h。 2.3.3 酶活力测定 1) 酶活定义：在40℃、pH8.0条件下，每分钟分解L-亮氨酸-4-硝基苯胺生成1μmoL对硝基苯胺所需的酶量为一个酶活力单位[6]。2) 测定方法:取O.4 mL稀释数倍的发酵滤液，加入到6 mLpH为8.O的Tris-HCl缓冲液中，，40℃水浴预热5min，加O.4 mL L-亮氨酸-4-硝基苯胺的乙醇溶液，准确反应15 min，立即放冰浴中，5 min后405nm处比色。3) 标准曲线的建立：配制一系列梯度浓度的对硝基苯胺标准溶液，以O含量为对照，在405 nm的波长，分别测定吸光度。以吸光度为纵坐标，对硝基苯胺浓度为横坐标，绘制标准曲线如下： 图 1 对硝基苯胺的吸光度标准曲线 4) 酶活力计算公式：氨肽酶活力（U/mL）＝ΔOD×6.8×D/(k×10×0.4) 公式中：k-消光系数；k＝0.0775；6.8-反应总体积；0.4-酶液体积； 15-恒温反应时间；D-稀释倍数 2.3.4 红曲菌产氨肽酶的液体发酵培养基的优化 1）碳源种类对红曲菌产氨肽酶的影响：将葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、乳糖分别按