ELISA实验指导.docx

实验材料、仪器和试剂材料新鲜植物材料仪器设备研钵，冷冻离心机，氮气吹干装置，酶联免疫检测仪，吸水纸，恒温箱，冰箱，96孔酶标板，可调微量液体加样器（10 μL，40 μL，200μL，1000μL），带盖瓷盘（内铺湿纱布）。试剂包被缓冲液：称取1.5 g Na2CO3, 2.93 g NaHCO3, 0.2 g NaN3（可不加）, 用量筒加1000 mL蒸馏水，pH为9.6。磷酸盐缓冲液（PBS）：称取8.0 gNaCl, 0.2 g KH2PO4, 2.96 g Na2HPO4·12H2O，用量筒加1000 mL蒸馏水，pH为7.5。样品稀释液：500 mL PBS中加0.5 mL Tween-20，0.5 g明胶（稍加热溶解）。底物缓冲液：称取5.10 g C6H8O7·H2O（柠檬酸），18.43 g Na2HPO4·12H2O，用量筒加1000 mL蒸馏水溶解，再加1 mL Tween-20，pH为5.0。洗涤液：1000 mL PBS加1 mLTween-20。终止液：2 mol/L硫酸。提取液：80％甲醇，内含1 mmol/L BHT(二叔丁基对甲苯酚为抗氧化剂，先用100%甲醇溶解BHT，再配成80%的浓度。否则BHT 难溶解)。各激素包被抗原、各激素抗体、激素标准物和辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（间接和简化间接酶免疫测定用试剂）。各激素抗体、激素标准物和各激素酶标物（直接酶免疫测定用试剂）。实验步骤样品中激素的提取称取0.5-1.0 g新鲜植物材料（若取样后材料不能马上测定，用液氮速冻后保存在-20℃的低温冰箱中），加2 mL样品提取液，在冰浴下研磨成匀浆，转入10 mL试管，再用2 mL提取液分次将研钵冲洗干净，一并转入试管中，摇匀后放置在4℃冰箱中。4℃下提取4 h，1000 g离心15 min(实验中离心机型号LDZ5-2，约4000 rpm), 取上清液。沉淀中加1 mL提取液，搅匀，置4℃下再提取1 h，离心，合并上清液并记录体积，残渣弃去。上清液过C-18固相萃取柱。具体步骤是： 80%甲醇（1 mL）平衡柱→上样→收集样品→移开样品后用100%甲醇（5 mL）洗柱→100%乙醚（5 mL）洗柱→100%甲醇（5 mL）洗柱→循环。将过柱后的样品转入5 mL塑料离心管中，真空浓缩干燥或用氮气吹干，除去提取液中的甲醇，用样品稀释液定容（一般0.5 g鲜重用1.5-3.0 mL左右样品稀释液定容）。样品测定包被：在10 mL包被缓冲液中加入一定量的包被抗原（最适稀释倍数见试剂盒标签），混匀，在酶标板每小孔中加100 μL。然后将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷盘内，置于37℃下3 h。洗板：将包被好的板取出，放在室温下平衡。然后甩掉包被液，将下口瓶内的洗涤液通过乳胶管均匀加入板上，使每孔充满洗涤液，放置约0.5 min,再甩掉洗涤液。重复3次，将板内残留洗涤液在吸水纸上甩干。竞争：即加标准物、待测样和抗体。加标样及待测样：取样品稀释液0.98 mL，内加20 μL激素的标样试剂（100μg/mL）,即为2000 ng/mL标准液，然后再依次稀释1000 ng/mL,500ng/mL,250ng/mL,125ng/mL,62.5 ng/mL，31.25 ng/mL，15.625 ng/mL，0ng/mL。将系列标准样加入96孔酶标板的前三行，每个浓度加3孔，每孔50 μL，其余孔加待测样，每个样品重复三孔，每孔50 μL。加抗体：在5 mL样品稀释液中加入一定量的抗体（最适稀释倍数见试剂盒标签）,混匀后每孔加50 μL，然后将酶标板加入湿盒内开始竞争。竞争条件37℃左右0.5 h。洗板：方法同包被之后的洗板。但要注意第一次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着加第二次。目的是防止各孔的相互干扰。加二抗：将一定量的酶标二抗，加入10 mL样品稀释液中（最适稀释倍数见试剂盒标签），混匀后，在酶标板每孔加100 μL，然后将其放入湿盒内，置37℃下，温育0.5h。洗板：方法同竞争之后的洗板（步骤4），洗五次，加底物显色：称取10-20mg邻苯二胺（OPD）溶于10 mL底物缓冲液中（小心勿用手接触OPD），完全溶解后加2-4μL 30% H202。混匀，在每孔中加100 μL（在暗处操作），然后放入湿盒内，当显色适当后（即0 ng/mL孔与2000 ng/mL孔的OD差值约为1.0左右时），每孔加入50 μL 2 mol/L硫酸终止反应。比色：在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物各浓度和各样品492 nm处的OD值。结果计算与分析标准曲线用于ELISA结果计算最方便的是logit曲线。曲线的横坐标用激素标样各浓度（ng/mL?）的自然对数表示，纵坐标用各浓度显色值的logit值表示。Logit值的计算方法