黑腹果蝇脱氧苷酸激酶(Dm-dNK)基因作为新的自杀基因治疗实体肿瘤.pdfVIP

中文摘要 黑腹果蝇脱氧核苷酸激酶(Dm—dNK)基因作为 新的自杀基因治疗实体肿瘤 前 言 ， 旧1989年开始肿瘤基因治疗用于临床试验，在世界范围内，已经 建立起一系列肿瘤基因治疗策略。国内外多年来恶性肿瘤全方位研究 己经明确：肿瘤的发生是一个多基因多步骤的复杂过程，用单一基因 治疗往往难以奏效；因此，”自杀”基因治疗已经成为肿瘤基因治疗中引 人注目的途径之一。单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HsV-TK)基因是近 年来国内外最广泛深入研究的”自杀”基因。与哺乳动物的胸腺嘧啶激酶 步在细胞内酶的作用下转变为二磷酸，三磷酸状态，三磷酸状态的核 苷酸类似物通过竞争正常的核苷酸，整合进入延伸的DNA链中，导致 链延伸的终止，从而使细胞死亡。大量的研究证明，无论是体外实验 还是动物模型实验，HSV—TK基因用于治疗各种不同的肿瘤均取得了 良好效果并己进入临床III期试验。目前认为肿瘤自杀基因治疗有四大 优点：第一，自杀基因在人体内的短期表达往往足以杀伤肿瘤细胞， 并不需要一般基因治疗所需要的长期表达；第二，自杀基因所带来的 毒性代谢产物可以杀死已产生化疗耐受的肿瘤细胞；第三，肿瘤的遗 传学异常无需知道；第四，因为存在旁观者效应，体内转染成功一小 部分阳性基因细胞，即可杀灭整个肿瘤，这在目前世界上还没有什么 方法能100％将目的基因转入目的细胞的情况下，对基因治疗最终能成 功应用于临床，无疑起到了极为关键的作用。然而已经实施的HSv— TK基因临床试验并没有达到在动物实验阶段的效果。因此，寻找新的 核苷酸类似物乃至新的”自杀”基因早已成为人们努力的一个新的方向。 Dm‘ kinase deoxyibonucleoside melanogaster 氧核苷酸激酶(Drosophila 以及更高的催化活性，其底物含盖了哺乳动物的四种脱氧核苷酸激酶 及Hsv—TK，催化活性提高10—100倍。这在目前核苷酸激酶家族中是唯 一的；Dm—dNK可以催化多种抗病毒及抗肿瘤的核苷酸类似物。 目前世界范围内基因治疗的主要障碍之一就是无法将目的基因转 移至足够数量的目的细胞中。因此，旁观者效应就成为基因治疗能否 成功用于临床并达到预期临床效果的关键因素。旁观者效应是指，由 于某种机制，阳性转染细胞内的毒性代谢物质转移到周边：限转染细胞 内，致使周边大量的非转染细胞死亡。自杀基因的这一特性，使得少 7 部分(一般认为lo％)的阳性基因转染细胞即州+杀灭整个肿瘤。， 本研究的目的就是在人体肿瘤细胞系水平，评估黑腹果蝇脱氧核 苷酸激酶能否在人类肿瘤细胞内表达并继续保持高的催化活性，以及 增强一系列的癌前药物(核苷酸类似物)的肿瘤杀伤效果，及其旁观 者效应；利用核苷酸还原酶抑制剂Hu可以影响dNTPs池的特性，研究 瘤细胞中的表达位点，并试图人工突变核信号，改变其亚细胞表达水 平，同时比较Dm—dNK不同亚细胞位点表达时其细胞毒性和旁观者效应 差别。为该基因作为新的更有效的自杀基因进一步用于动物模型实 验，乃至早期临床试验打下必要的基础。 f f实验方法 ＼ 一．构建表达Dm—dNK的逆转录病毒载体 应用基于Moloney鼠自皿病病毒构建含有Dm．dNK cDNA的复制缺 陷型逆病毒载体，利用相应的酶切位点将含有Dm。dNK cDNA片段克隆 自动测序仪测序证实。 PT67包装