上呼吸道上皮细胞的原代培养及其及11型人乳头状瘤病毒结合的研究.pdfVIP

上呼吸道上皮细胞的原代培养及其与11型 人乳头状瘤病毒结合的研究 中文摘要 目的：建立原代培养人呼吸道鳞状上皮细胞与假复层纤毛柱状上皮细胞的 方法，比较l1型人乳头状瘤病毒与两种上皮细胞的结合能力是否存在差异，并 对细胞表面硫酸乙酰肝素分子在病毒与细胞表面的结合过程发挥的作用进行初 步探讨。 方法：取成人正常上呼吸道粘膜，利用无血清培养基对鳞状上皮细胞进行 原代培养，无血清培养基以及气．液界面培养联合应用进行假复层纤毛柱状上皮 细胞的原代培养及诱导分化；所得细胞与ll型人乳头状瘤病毒样颗粒进行结合 反应，免疫印迹法检测病毒样颗粒与细胞是否发生结合，ELISA检测结合于细 胞表面的病毒样颗粒的吸光值，并比较病毒样颗粒与两种上皮细胞的结合能力 是否存在统计学差异；用硫酸乙酰肝素的竞争性抑制物肝素及其特异性酶．乙酰 肝素酶干预病毒样颗粒与细胞的结合，检测干预前后病毒．细胞结合率的变化， 推测硫酸乙酰肝素在病毒．细胞结合过程中所起的作用。 结果： 1．利用无血清培养基培养的人呼吸道鳞状上皮细胞，呈扁平、多角形，核 居中，可见l～2个核仁，胞浆透明，无颗粒，细胞连接成片后呈典型的鹅卵石 路面状，经抗人角蛋白多克隆抗体染色呈阳性，证实为上皮细胞；气一液界面培 养的假复层纤毛柱状上皮，以及气一液界面培养所得到的假复层纤毛柱状上皮细 胞纤毛分化良好，接近生理状态。 2．免疫印迹检测显示：11型人乳头状瘤病毒样颗粒与呼吸道鳞状上皮细 胞及假复层纤毛柱状上皮细胞结合后，用抗11型人乳头状瘤病毒样颗粒的单克 隆抗体可检测到阳性条带，说明病毒样颗粒与两种上皮细胞均可发生结合。 ELISA检测结合于细胞表面的病毒样颗粒的吸光值，鳞状上皮细胞组A450为 (0．81±0．12，n=6)，假复层纤毛柱状上皮细胞A450为(0．76±0．10， n=6)，两组数据经组间t一检验，差别无统计学意义。 3 3．肝素以及乙酰肝素酶对细胞表面的预处理都可抑制11型人乳头状瘤病 毒样颗粒与呼吸道上皮细胞的结合，且该抑制作用在一定范围内与干预物的浓 度呈正相关；当干预物超过一定浓度后，病毒颗粒与细胞的结合会稳定在一个 较低水平，但不会完全被阻断。 结论： 1．无血清培养基以及气一液界面培养法是原代培养呼吸道鳞状上皮细胞与 假复层纤毛柱状上皮细胞的有效方法，培养细胞纯度高、分化好、细胞形态与 生理状态接近。 2．11型人乳头状瘤病毒可在体外与呼吸道上皮细胞结合，且与两种上皮 细胞的结合能力无差异，因此，11型人乳头状瘤病毒在呼吸道内不同区域感染 率的差异不是在病毒一细胞结合阶段产生。 3．细胞表面的硫酸乙酰肝素分子参与11型人乳头状瘤病毒与呼吸道上皮 细胞的结合过程，并发挥十分重要的作用，硫酸乙酰肝素可能是11型人乳头状 瘤病毒的细胞表面受体。 关键词：人乳头状瘤病毒，上皮细胞，细胞培养技术，病毒结合，免疫印迹， ELISA，硫酸乙酰肝素，细胞表面受体 中图分类号：R767 4 ofhuman 1 Bindingassay papillomavirus一1 and human cells primaryrespiratoryepithelial Abstract andcultureof anefficientmethodfordirectisolation establish primary Objective．To human cellsfromnormal theattachment epithelial